[发明专利]用来同时检测四种无浆体的四重PCR专用引物组合及四重PCR检测方法

权利要求书

1.用来同时检测四种无浆体的四重PCR专用引物组合，其特征在于：引物的核苷酸序列为：

山羊无浆体groEL基因位点专用引物序列：

Acgroelf：5’-TGAAGAGCATCAAACCCGAAG-3’

Acgroelr：5’-CTGCTCGTGATGCTATCGG-3’；

牛无浆体groEL基因位点专用引物序列：

Abgroelf：5’-GTGGGATGTACTGCTGGACC-3’

Abgroelr：5’-ATGGGGAGAGATATCCGCGA-3’；

绵羊无浆体msp4基因位点专用引物序列：

Aomsp4f：5’-TGAAGGGAGCGGGGTCATGGG-3’

Aomsp4r：5’-GAGTAATTGCAGCCAGGCACTCT-3’；

嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因位点专用引物：

Ap16sf：5’-AGTGCTGAATGTGGGGATAATTTATCTCCGTG-3’

Ap16sr：5’-CTAATCTCCATGTCAAGGAGTGGTAAGGTT-3’。

2.根据权利要求1所述的用来同时检测四种无浆体的四重PCR专用引物组合，其特征在于：所述牛无浆体groEL基因位点专用引物扩增产物大小为529 bp，山羊无浆体groEL基因位点专用引物扩增产物大小为874 bp，绵羊无浆体msp4基因位点专用引物扩增产物大小为347 bp，嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因位点专用引物扩增产物大小为172 bp。

3.利用权利要求1所述的用来同时检测四种无浆体的四重PCR专用引物组合进行四重PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）待测样品DNA的提取；

（2）将引物对分别配置成浓度为20 μM的溶液；

（3）以待测样品DNA为模板进行四重PCR扩增： 25 μL PCR反应体系为：LA Taq DNAPolymeras 0.25 μL，10 × LA Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，四组引物各0.4 μL，DNA模板2.0 μL，灭菌去离子水补足至25 μL；

PCR扩增反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1min，运行35个循环，72℃延伸10 min；

（4）扩增产物的判定方法：PCR反应终止后，取5 μL PCR产物，用1.5 %琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到529 bp大小产物则判定为样品中含有牛无浆体，扩增得到874 bp大小产物则判定为样品中含有山羊无浆体，扩增得到347 bp大小产物则判定为样品中含有绵羊无浆体，扩增得到172 bp大小产物则判定为样品中含有嗜吞噬细胞无浆体。