[发明专利]用来同时检测四种无浆体的四重PCR专用引物组合及四重PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种同时检测四种无浆体的多重PCR专用引物和四重PCR检测方法，牛无浆体专用引物扩增产物大小为529 bp，山羊无浆体专用引物扩增产物大小为874 bp，绵羊无浆体专用引物扩增产物大小为347 bp，嗜吞噬细胞无浆体专用引物扩增产物大小为172 bp。四重PCR反应体系为：LA Taq DNA Polymeras 0.25μL，10×LA Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 4.0μL，四个引物对各0.4μL，DNA模板2.0μL，灭菌去离子水补足至25μL；四重PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火30s，72℃延伸1 min，运行40个循环，72℃延伸10 min；该方法有着检测速度快，敏感性高，特异性强、高效、低成本等优点，适于四种病原所引起疾病的流行病学调查和临床确诊。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用来检测四种无浆体的PCR引物组合及四重PCR检测方法。

背景技术

无浆体(Anaplasma)属于专性胞内寄生的真核生物，革兰阴性菌，罗曼诺斯基(Romanowsky)染色，表现为蓝色或紫色的细胞内包涵体。无浆体属的病原体，如：山羊无浆体(A.capra)、牛无浆体(A.bovis)、绵羊无浆体(A.ovis)和嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytophilum)，可感染牛、羊、犬等家养动物，也可感染狍子、梅花鹿、獐等野生动物，也有人感染山羊无浆体、绵羊无浆体和嗜吞噬细胞无浆体的报道。2-4种无浆体混合感染的情况均有相关报道。无浆体广泛分布于世界各地，对人和动物的健康危害严重。山羊无浆体是一种潜在的蜱传无浆体新物种，首次于2012年在中国无症状的山羊体内发现和报道，其在血液中的寄生部位尚不明确。2015年在有硬蜱叮咬史的病人体内检测到了该病原，可能导致不明原因的无浆体病，难于与急性发热性疾病区分开，易造成误诊。据报道，山羊无浆体在中国和韩国分布广泛，其宿主包括人、反刍动物、野生动物等。

牛无浆体可感染小型哺乳动物和反刍动物的单核细胞和巨噬细胞，1936年首次在牛体内发现。它可导致包括体重减轻、发热、贫血、淋巴结肿大等多种临床症状，甚至可造成死亡。牛无浆体主要分布在亚洲，非洲和南美洲，北美州和欧洲南部亦有报道。宿主包括山羊、绵羊、犬和一些小型野生哺乳动物等。

绵羊无浆体寄生于血液中的红细胞，最早于1912年由Bevan在贝尔的绵羊中发现，也有野生反刍动物和犬感染的相关报道。Chochlakis等2010年曾在人体内检测到绵羊无浆体的变异株，表现为以发热、肝脾肿大和淋巴结病变为特征的疾病，认为该病原具有潜在的人兽共患性，对人类健康存在潜在威胁。该病原分布广泛，非洲，亚洲，欧洲和北美洲等均有报道。该病原宿主主要有绵羊、山羊、犬等。

嗜吞噬细胞无浆体寄生于血液中的中性粒细胞，可导致人粒细胞无形体病(HGA)，亦称为“蜱传热”，伴有急性发热性血小板减少综合征。该病原在亚洲、欧洲和北美洲均有分布，在南美洲和非洲也有报道。其宿主广泛，包括人、食肉动物、反刍动物、啮齿动物、食虫动物、鸟类和爬行动物等。

对动物或人体内无浆体的实验室病原检测，传统上主要依赖于血液样本的显微镜检查。然而，由于不同无浆体种之间以及与血液内其它寄生虫如巴贝斯虫属(Babesia)或泰勒虫属(Theileria)病原的寄生部位及其大小、形态结构相似，显微镜检查很难将它们区分开来。近年来，不断有PCR技术应用于无浆体的病原检测中，如PCR、巢式PCR、荧光定量PCR用于检测无浆体属的多种病原，双重PCR用于检测边缘无浆体(A.marginale)和嗜吞噬细胞无浆体以及双重荧光定量PCR用于检测边缘无浆体和中央无浆体(A.centrale)等，具有敏感性高，特异性强等优点。然而，我们的前期研究结果表明，多种无浆体混合感染的现象普遍存在，而单种或少数几种无浆体PCR检测方法费工、费时、检测效率低，用于同时检测三种及其以上无浆体的四重PCR方法尚未见报道。本研究旨在建立一种用来同时检测四种无浆体的四重PCR方法，为人和动物无浆体病以及媒介硬蜱体内无浆体的病原检测和流行病学调查提供一种检测效率高、方便快捷、节约时间和成本、敏感性高、特异性强的技术方法。