[发明专利]一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌BL21作为宿主，表达重组质粒pET‑28(a)‑TPL及25个酪氨酸酚解酶突变体，得到了含有突变质粒生产L‑DOPA的重组大肠杆菌，利用获得的重组菌全细胞转化生产L‑DOPA，其中表达pET‑28(a)‑TPL(E313M)的重组菌生产L‑DOPA产量达到54.9g/L，相比对照菌株提高了142.9％，其表达的酪氨酸酚解酶的在20℃，40℃，60℃条件下的半衰期分别提高至37.9min，17.1min，14.6min，为代谢工程改造大肠杆菌生产L‑DOPA奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种表达热稳定型酪氨酸酚解酶的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

左旋多巴(L-DOPA)是氨基酸的一种衍生物，也是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物，又称3,4-二羟基苯基丙氨酸，是一种重要的活性物质。L-DOPA是新型的生化药品，在食品、医药和保健品等领域都具有广泛应用。L-DOPA的衍生物——多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。

Birkmayer于1961年用L-DOPA治疗帕金森氏病获得明显疗效。L-DOPA及复方L-DOPA(如美多芭)已成为治疗常见老年病——帕金森氏病的主要药物。L-DOPA还可用来治疗弱视；利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化，经L-DOPA形成黑色素，可用于毛发染色；此外，人们还发现L-DOPA有抗衰老的功效。基于L-DOPA在医药卫生、保健美容等诸多领域的显著功效，L-DOPA的生产很早就被人们所关注。

根据文献报道，L-DOPA的制备方法主要有提取法、化学合成法和酶转化法。

1、提取法

L-DOPA在自然界中主要存在于蚕豆、毛豆等植物中，提取法中免去了与手性异构体D-DOPA的拆分工艺，并且L-DOPA的提取得率也相应得到了一些提高，但由于受到原料来源少、产量低的限制，因而生产成本高，从植物中提取L-DOPA难以大规模生产，远不能满足市场需求。

陈勇等(中草药，1993，24(6)：294)用薄层扫描法测定广西东兰猫豆M.pruriens，广西药用植物园及云南西双版纳藜豆M.macrocarpa Wall中L-DOPA的含量在4.16％～4.94％之间。

刘新民等(中药材，1994，17(10)：31)发现产自云南、四川的黎豆属植物Mucunasempervirens Hemsl中L-DOPA含量为6.65％。

蒋伟哲等(中草药，2000，31(11)：860)发现采自广西宜州市、百色市、北海市、东兰县、田东县五个产地的猫豆中L-DOPA的含量为5.62％～6.83％，而去皮后L-DOPA在种肉中的含量高达6.99％～9.35％，在种皮中的含量仅为0.25％～0.43％。

2、化学合成法

自从Monsanto团队(2004，Wiley-VCH Verlag GmbHCo.KGaA，Weinheim，p(21-38))首次采用香草醛和乙内酰脲为原料通过不对称法合成L-DOPA以来，化学法被广泛应用于L-DOPA的商业化生产，但化学合成过程中需要大量的铅等金属作为催化剂，并且过程繁杂，产物的转化效率和对映选择性均较低，同时具有成本高、环境污染严重等问题。

3、酶转化法

3.1酪氨酸酶