[发明专利]一种茶树蔗糖合酶CsSUS2、制备方法及应用

权利要求书

1.一种茶树蔗糖合酶CsSUS2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

目的基因克隆：以茶树cDNA为模板，设计引物，然后进行PCR反应；

其中，引物序列：

SalI：5’-gatatcggatccgaattcgagctccgtcgacgcatggggagaaggttgatgaaacccca-3’，

Notl：5’-gtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcttaggaaacatgcctggccgtaggttctg-3’；

PCR反应体系：500ng/μL的茶树cDNA模板2μL，10μM的上、下游引物各2μL，高保真聚合酶24μL，ddH2O添至50μL；

构建表达载体：构建连接体系，置于37℃水浴25-30min再冰浴5min；

其中，连接体系为：5×CEⅡBuffer取2μL，pET-32a⁺取3μL，PCR产物2μL，ExnaseⅡ试剂1μL，ddH2O添至10μL；

转化：将构建载体转化至感受态细胞中，扩大培养得含CsSUS2基因全长的工程菌；

茶树蔗糖合酶的分离纯化：离心取沉淀，－80℃下放置2-4h；加入1×washbuffer，超声破碎后离心得沉淀；沉淀加水混匀后过纯化柱，得茶树蔗糖合酶CsSUS2。

2.如权利要求1所述的茶树蔗糖合酶CsSUS2制备方法，其特征在于，PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.如权利要求1所述的茶树蔗糖合酶CsSUS2制备方法，其特征在于，第一次离心条件为：4℃、5000rpm，离心时间为10min，且重复一次；第二次离心条件为：4℃、10000rpm，离心时间为20min。

4.一种根据权利要求1所述的茶树蔗糖合酶CsSUS2制备方法制得的茶树蔗糖合酶CsSUS2。

5.一种根据权利要求4所述的茶树蔗糖合酶CsSUS2在合成苯乙醇糖苷中的应用。

6.如权利要求5所述的茶树蔗糖合酶CsSUS2在合成苯乙醇糖苷中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1，PH值为7.5且100mM的Tris-Hcl、DTT、2.5mM的UDPG、10μg/μL的GT、20mM的苯乙醇、10μg/μL的茶树蔗糖合酶CsSUS2、100M的蔗糖以体积比21:1:1:1:1:1:1混合，然后30℃、400rpm条件下反应10h；

S2，加入色谱级乙酸乙酯萃取，4℃、15000rpm条件下离心30-40min，分别得乙酸乙酯层和溶液层；

S3，溶液层重复S2操作，合并两次乙酸乙酯层，真空浓缩，得固体苯乙醇糖苷。