[发明专利]一种茶树蔗糖合酶CsSUS2、制备方法及应用

说明书

本发明属于分子生物技术领域，特别涉及一种茶树蔗糖合酶CsSUS2、制备方法及应用，包括以茶树cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因；构建连接体系反应得表达载体；将构建载体转化至感受态细胞中并扩大培养；茶树蔗糖合酶的分离纯化。本发明从制备的蔗糖合酶CsSUS2纯度高，能促进UDP‑Glucose的原位再生，提高苯乙醇糖苷的合成效率。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，特别涉及一种茶树蔗糖合酶CsSUS2、制备方法及应用。

背景技术

蔗糖运输是茶树生长发育过程中负责碳资源配置的中心系统。具体流程为茶树在生长发育过程中，通过协调体内不同器官和不同位置细胞的蔗糖合成和分解位点来控制碳的分布。而茶树蔗糖合酶对蔗糖的合成和分解具有可逆的催化作用，其为调控蔗糖的分配提供了直接和可逆的手段。根据代谢环境，茶树蔗糖合酶通过与细胞膜、细胞器和细胞骨架肌动蛋白的相互作用改变其在细胞中的位置，从而直接影响茶树不同位置纤维素、淀粉的生物合成，以及愈伤组织的形成。

苯乙醇糖苷是一类植物源天然产物，是以苯乙醇基及其衍生物(羟基、甲氧基苯乙醇)为苷元，以葡萄糖、鼠李糖等为糖配基合成的糖苷类化合物。苯乙醇糖苷具有免疫调节、抗癌症、抗疲劳、抗衰老，保护神经系统等多种药理活性，大量研究表明:该类化合物具有广泛的药理活性，如:抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、增强免疫力、神经保护、保肝、强心等广泛应用于保健食品、环境适应药品以及化妆品行业。

目前苯乙醇糖苷的制备方法：(1)传统制备方法是从植物中直接提取，一般采取水或有机溶剂萃取，例如醇提法，以醇类作为提取溶剂将苯乙醇糖苷成分提取出来，醇提工艺适合工业化生产，仍然是研究较多的工艺，但是，传统制备方法是受植物体本身性质影响较大，含有苯乙醇糖苷的植物资源稀有，且含量比较低，而且提取工艺复杂；(2)化学合成制备，化学合成是解决市场需求的有效途径，主要是以酪醇类似物为底物，以重金属盐为主要催化剂进行糖苷化反应，但是，化学合成糖苷技术往往存在反应条件复杂、不易控制、对实验设备要求较高、步骤多、原料价格昂贵等缺点，且大都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，也非常容易造成环境污染问题；(3)生物酶法制备，苯乙醇糖苷的最后一步反应是由糖基转移酶(GT)所催化的，特异性的催化糖基从活性中间体UDP-Glucose(UDPG，尿苷二磷酸葡萄糖)转移到酪醇分子上，近年来，人们从天然植物种子材料、真菌中提取酶或将全细胞用于催化实验，利用固液体发酵或工业转化等手段合成苯乙醇糖苷。生物催化合成方法由于高效、环境友好等优势，一直是学术研究和工业应用所关注的热点技术，但是，以UDP-Glucose(UDPG，尿苷二磷酸葡萄糖)为反应底物成本高，尿苷二磷酸(UDP)作为糖苷制备的反应的产物之一会很大程度地抑制GT活性，随着UDP在反应混合物中的积累，反应速率将会逐渐降低。所以，本发明探索分离纯化了一种茶树蔗糖合酶，并将其应用到苯乙醇糖苷的制备中。

发明内容

本发明从制备的蔗糖合酶CsSUS2纯度高，能促进UDP-Glucose的原位再生，提高苯乙醇糖苷的合成效率。

本发明提供了一种茶树蔗糖合酶CsSUS2的制备方法，包括以下步骤：

目的基因克隆：以茶树cDNA为模板，设计引物，然后进行PCR反应；

其中，引物序列：

SalI：5’-gatatcggatccgaattcgagctccgtcgacgcatggggagaaggttgatgaaacccca-3’，

Notl：5’-gtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcttaggaaacatgcctggccgtaggttctg-3’；

PCR反应体系：500ng/μL的茶树cDNA模板2μL，10μM的上、下游引物各2μL，高保真聚合酶24μL，ddH2O添至50μL；