[发明专利]一种鸡GM-CSF蛋白、其单克隆抗体、其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910314507.7 | 申请日： | 2019-04-18 |
| 公开（公告）号： | CN110272478A | 公开（公告）日： | 2019-09-24 |
| 发明（设计）人： | 任广彩;陈瑞爱;黄妙容;李延鹏;罗琼;张文炎;刘之文 | 申请（专利权）人： | 肇庆大华农生物药品有限公司;华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/535 | 分类号： | C07K14/535;C07K16/24;C12N15/70;A61K39/00;A61K39/395;A61P35/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 深圳市道臻知识产权代理有限公司 44360 | 代理人： | 陈琳;朱亚 |
| 地址： | 526000 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 蛋白 制备方法和应用 原核表达载体 单克隆抗体 种鸡 制备 基因工程技术 原核表达系统 表达载体 蛋白制备 化学合成 基因合成 基因来源 基因序列 诱导表达 省时 省力 合成 基因 | ||
1.一种鸡GM-CSF蛋白的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：
(1)、合成SEQ ID NO.1所示的鸡GM-CSF基因序列；
(2)、将SEQ ID NO.1序列克隆到pGEX-4T-1载体上，得到原核表达载体pGEX-4T-1-GM-CSF；
(3)、对步骤(2)得到的原核表达载体pGEX-4T-1-GM-CSF用IPTG进行诱导表达；
(4)、对步骤(3)高速离心收集诱导后的菌体进行纯化，得到鸡GM-CSF蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：将原核表达载体pGEX-4T-1-GM-CSF按照1:100接种于添加氨苄的LB培养基中37℃220rpm震荡培养，培养至OD600为0.6-0.8时，往培养基中添加IPTG至终浓度为1.0mmol/L、37℃继续诱导培养4h，高速离心收集诱导后的菌体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)的具体步骤为：对步骤(3)高速离心收集诱导后的菌体用Pro Affinity Concerntration Kit Ni-NTA纯化。
4.由权利要求1～3所述制备方法制备得到的一种鸡GM-CSF蛋白。
5.权利要求书4所述的一种鸡GM-CSF蛋白在制备疫苗中的应用。
6.一种鸡GM-CSF蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括下述步骤：
(a)、将权利要求1～3中任一权利要求制备得到的鸡GM-CSF蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射免疫BALB/c小鼠，初次免疫后每隔14天进行第二次免疫；同样间隔14天进行第3次免疫，细胞融合前3-5天加强免疫一次；
(b)、取离体免疫BALB/c小鼠脾脏，与对数生长期的SP2/0细胞融合，将HAT选择培养液加入到细胞融合物，悬浮细胞，分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2的温箱中培养；
(c)、间接ELISA方法检测融合细胞培养上清液，以P/N≥2判定为阳性；
(d)、选择2-3次检测为阳性的杂交瘤细胞孔，用有限稀释法连续克隆，将克隆化的杂交瘤细胞扩大培养；
(e)、采用体内诱生法制备单克隆抗体。
7.由权利要求6所述制备方法制备得到的一种鸡GM-CSF蛋白单克隆抗体。
8.权利要求书7所述的一种鸡GM-CSF蛋白单克隆抗体在制备疫苗中的应用。
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