[发明专利]一种EGFR T790M和C797S顺式突变的检测方法

权利要求书

1.一种EGFR顺式突变的检测方法，其特征在于基于Blocker PCR技术，在野生型EGFR基因的正义链和反义链上分别选择不同待测突变位点设计相应的Blocker，所述Blocker能够分别与野生型EGFR基因的正义链和反义链的待测突变位点结合，形成稳定的杂交体，阻止上、下游引物扩增野生型以及发生单一突变或反式突变的EGFR基因。

2.如权利要求1所述的EGFR顺式突变的检测方法，其特征在于所述EGFR顺式突变为T790M和C797S顺式突变。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述Blocker如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述方法使用的EGFR上游引物序列如SEQID NO.3所示，EGFR下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

5.如权利要求1所述的EGFR顺式突变的检测方法，其特征在于进一步在EGFR上、下游引物中间保守区域设计Taqman探针或分子信标，或者使用荧光染料SYBR Green或Eva Green，用于观察或者定量上下游引物PCR扩增情况。

6.如权利要求1所述的EGFR顺式突变的检测方法，其特征在于采用焦磷酸测序技术、Sanger测序法、NGS测序法或聚合酶链式反应－单链构象多态性分析进行测序。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于采用焦磷酸测序技术进行测序，所述EGFR上游引物或下游引物的5’端有生物素标记。

8.如权利要求1-7任一项所述的EGFR顺式突变的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)在EGFR基因待测突变位点的两端设计上、下游引物用于PCR扩增待测突变位点基因序列，上、下游引物其中一条5’端有生物素标记；同时在野生型EGFR基因的正义链和反义链上分别选择不同待测突变位点设计相应的Blocker，所述Blocker能够分别与野生型EGFR基因的正义链和反义链的待测突变位点结合，形成稳定的杂交体阻止上、下游引物扩增野生型以及发生单一突变或反式突变的EGFR基因；

(2)配制PCR反应体系；

(3)在上述反应体系中加入临床血浆样本提取的游离核酸，进行PCR扩增；

(4)将PCR扩增产物和对应的测序引物加入测序体系中进行测序；

(5)根据测序结果判读对应位点是否存在突变及突变类型。

9.一种基于Blocker PCR技术检测EGFR顺式突变的Blocker，其特征在于所述EGFR顺式突变为T790M和C797S突变，所述Blocker的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

10.一种EGFR顺式突变检测试剂，其特征在于所述EGFR顺式突变为T790M和C797S突变，包括Blocker序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，EGFR上游引物序列如SEQ ID No.3所示，EGFR下游引物序列如SEQ ID No.4所示。

11.如权利要求10所述的检测试剂，其特征在于还包括Taqman探针或分子信标，或者荧光染料SYBR Green或Eva Green。