[发明专利]一种EGFR T790M和C797S顺式突变的检测方法

说明书

本发明公开了一种EGFR顺式突变的检测方法，基于Blocker PCR技术，在野生型EGFR基因的正义链和反义链上分别选择不同待测突变位点设计相应的Blocker，所述Blocker能够分别与野生型EGFR基因的正义链和反义链的待测突变位点结合，形成稳定的杂交体阻止上、下游引物扩增野生型以及发生单一突变或反式突变的EGFR基因。本发明方法简便，能够有效的区分EGFR顺式构型突变与反式构型突变，而且灵敏度高，即使在外周血样本中也可以检出低至0.1％的突变，对TKI的耐药突变的临床诊断具有非常高的应用价值。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于Blocker PCR技术的EGFR顺式突变的检测方法。

背景技术

EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。其中外显子20上的T790M替代突变为一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)的耐药突变。TKI一直是EGFR突变型NSCLC靶向治疗中的重要药物，但是大多数具有敏感EGFR突变的患者在第一代EGFR TKI治疗9-13个月会出现耐药性进展。在所有的耐药机制中，EGFR T790M突变占60％左右的比例。第三代EGFR-TKI泰瑞沙/Tagrisso(又名奥希替尼/Osimertinib，AZD9291)是不可逆的选择性TKI，可以有效应对T790M突变的新一代靶向药物，为克服T790M继发耐药带来了希望，但最终也会耐药。约30％为EGFR继发C797S突变。

C797S和T790M突变在不同等位基因上为反式构型突变，患者可以使用第一代和第三代EGFR-TKI联合控制(如特罗凯联合奥希替尼)。C797S和T790M在同一等位基因上为顺式构型突变，目前没有任何靶向药物可以控制，患者只能穿插化疗、抗血管生成的靶向药物，以及适当空窗，等耐药基因丢失后，寄希望之前耐药的靶向药物可以重新复敏。

现有技术下，二代基因测序技术(NGS)能够辨别C797S和T790M的突变构型，而其他PCR技术，如ARMS PCR或者数字PCR只能进行单点检测无法对构型做出明确的判断。二代基因测序技术(NGS)具有通量大，精确度高和信息量丰富的特点，但是用时较长，实验设计复杂，数据分析量大，成本也居高不下。目前仍然缺少一种简便、有效的方法准确检测EGFR顺式构型突变。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种基于Blocker PCR技术的EGFR顺式突变的检测方法，通过设计Blocker，特异性的抑制野生型以及反式突变模板的扩增，PCR结束时产物中的顺式突变型模板比例明显增大，更有利于突变的检测，大大提高突变检测的灵敏度。

本发明具体技术方案如下：

一种EGFR顺式突变的检测方法，其特征在于基于Blocker PCR技术，在野生型EGFR基因的正义链和反义链上分别选择不同待测突变位点设计相应的Blocker，所述Blocker能够分别与野生型EGFR基因的正义链和反义链的待测突变位点结合，形成稳定的杂交体阻止上、下游引物扩增野生型以及发生反式突变的EGFR基因。

本发明所述EGFR顺式突变的检测原理如图1所示，其中顺式突变为同一等位基因上的两处顺式构型突变，反式突变为在不同等位基因的两处反式构型突变(也可以理解为单一突变的情形)。Blocker序列与野生型一致，结合的区域可能存在待检的突变，当此区域没有突变时，Blocker会结合在此区域并抑制扩增引物的结合和延伸，造成扩增效率大大下降；而此区域有突变时，Blocker无法结合在此区域，扩增引物可以有效的结合和延伸，突变型模板的扩增不受Blocker的抑制可以正常扩增。