[发明专利]一种黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法

说明书

本发明公开了一种黑曲霉6‑4光修复酶及其构建方法，所述的黑曲霉具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。构建方法为从现有的野生型黑曲霉中获得6‑4光修复酶基因基因An6‑4，重新设计核苷酸序列，选择大肠杆菌表达系统偏好的密码子进行优化，得到改造后的基因An6‑4'，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出工程菌，所述的工程菌在20℃和1mM IPTG条件下获得了较好的表达。本发明与现有技术相比，成功在异源表达系统中表达出的6‑4光修复酶，获得活性可溶蛋白，具有抗氧化能力极好，而且活性持久稳定的特点，可以在生物医药、化妆品领域应用。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉DNA光修复酶基因及其构建方法。

背景技术

自然条件下紫外线分为三个波段，分别是短波紫外线UVC(200-280nm，杀菌区)，中波紫外线UVB(280-315nm，皮肤红斑区)，长波紫外线UVA(315-400nm，黑光区)。由于大气臭氧层的存在，伤害能力最大的UVC被阻挡，到达地球表面的主要是UVB和UVA波段。而阳光中的中波紫外线UVB会诱导DNA上产生损伤，从而破坏DNA的结构，使DNA的正常复制和转录受到阻碍，引起皮肤及组织细胞内的信号通路发生改变，造成免疫的抑制，皮肤的炎症，甚至造成皮肤癌。其原理是UVB能直接被皮肤细胞DNA吸收，引起DNA上两个相邻的胸腺嘧啶产生稳定共价结合的二聚体，包括环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光产物(6-4photoproduct)，这两类二聚体破坏DNA正常结构，从而抑制DNA的复制与转录，引起细胞内信号通路的紊乱，从而造成皮肤疾病甚至是皮肤癌(李沛波，关永源，贺华，丘钦英et al.中波段紫外线对角质形成细胞凋亡的诱导和钙信号的影响[J].中国药理学通报，2004,20(4)：398-402.)。

地球上的早期生命诞生于海洋，由于缺乏臭氧层的保护，原始的生命体需要在紫外线极强的环境中生存下来，就形成了多种抵抗紫外线的机制。原始的生命为适应恶劣环境，具有一种具备光修复的蓝光受体：类似于光修复酶利用蓝光修复DNA损伤。随着生物不断进化，这种蓝光受体逐渐分化成今天的光修复酶。光修复酶是一类在细菌、真菌、植物和动物中都普遍存在，在修复紫外线造成的DNA损伤中发挥重要作用的酶。根据修复底物的不同，可以分为CPD光修复酶和6-4光修复酶。两种光修复酶都以非共价的形式结合FAD辅酶，是最常见的辅酶形式。与自然界中利用NADH或是亚铁血红素类似，FAD作为电子传递的中间体，可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应，传递电子。FAD主要存在三种基本形式：完全氧化型(oxidized，OX)；单电子还原态即自由基型(semiquinone，SQ)；双电子还原态即完全还原型(hydroquinone，HQ)。在光修复酶中，必须依赖双电子还原态FAD辅酶执行功能。

随着科学技术的发展，人类破坏自然的活动加剧，造成大气中臭氧层稀薄甚至产生空洞，阻挡紫外线的能力减弱。于是到达地球表面的UVB，剂量逐渐增强，导致人类各种皮肤损伤的发病几率大大增加。自1999年德国科学家报道光修复酶修复受损人类臀部皮肤的研究后，将光修复酶作为化妆品的添加成分，逐渐成为防晒产品的主流。以往研究人员对CPD光修复酶的研究已经很充分了，而对于6-4光修复酶的研究较为稀缺。

黑曲霉(Aspergillus niger)作为一种常见的曲霉属真菌，分布极其广泛，是重要的发酵工业菌种，对紫外线耐受能力强，然而由于黑曲酶6-4光修复酶基因(GenBank中的登录号为XM_001397421.2)的GC碱基含量及密码子的差异，使黑曲酶的基因在异源原核宿主中的表达常常受限。特别是大肠杆菌，其作为低等的原核生物，缺乏完善的翻译后修饰系统，真核生物蛋白在其中常无法表达或以包涵体形式存在，不能获得活性可溶蛋白。

发明内容：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的第1个技术问题是提供了一种黑曲霉6-4光修复酶基因。

本发明所要解决的第2个技术问题提供是含有该基因的表达载体。