[发明专利]快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法。该试剂盒，包括细胞裂解液、扩增反应液、胶体金检测液和免疫层析试剂条，其特征在于：其中MecA的转录产物和16S rRNA由扩增反应液中的引物对经NASBA扩增获得。该快速检测葡萄球菌MecA基因的试剂盒检测结果稳定，准确率、灵敏度高，成本低，用时短，适合临床推广。该检测方法适用于临床上快速检测耐甲氧西林的葡萄球菌和鼻咽部葡萄球菌的筛查，快速精准，设备简单，对操作人员要求低，具有作为床旁检测和在各级医院应用的潜力。

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体是指一种快速检测葡萄球菌MecA的试剂盒及方法。

背景技术

包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)在内的葡萄球菌在人群和自然环境中分布广泛，它们是人类和动物的皮肤和黏膜上的正常定植菌，可以从土壤，水，牛奶，食物等中被分离出来(Miragaia 2018)(Huijbers et al.2015)。虽然葡萄球菌属在大多数情况下只是作为定植菌存在，并不会对机体产生危害，但是当宿主处于免疫功能低下或者皮肤、黏膜屏障受损时，它们的侵袭潜能就会显现出来，从而导致医院或社区获得性感染(Natsis and Cohen 2018；Poulakou et al.2019)。

抗生素耐药性对于预防和治疗细菌感染来说是一个威胁。(Miragaia 2018).对于葡萄球菌的感染来说，耐甲氧西林的葡萄球菌由于它的高流行率而备受关注。据报道，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)在金黄色葡萄球菌中的平均分离率是35.3％，最高是62.1％最低是10.0％，而在2017年中国的凝固酶阴性葡萄球菌中，甲氧西林耐药的比率是80.3％(最高100.0％，最低49.0％)(www.chinets.com)。对于韩国、日本和意大利来说，2017年的甲氧西林耐药的葡萄球菌分别占53.0％，41％和34.0％

(resistancemap.cddep.org/AntibioticResistance.php)。因此，MRS的流行依然是一个值得警惕的全球健康问题。(Lindsay 2013；Miragaia 2018；Otto 2013)

抗生素延迟给药，抗生素治疗不足以及甲氧西林抗性都会导致金黄色葡萄球菌菌血症的预后较差(Lodise et al.2003)。跟β-内酰胺类的抗生素相比，糖肽类化合物也与预后不良有关(Mcneil et al.2017)。因此，有必要建立一种快速可靠的方法来鉴定MRS，为临床医生提供抗生素耐药性结果。由于质谱法在临床微生物学实验室的广泛应用，葡萄球菌种属的快速鉴定通常不再是问题(Pinault et al.2019；Simon et al.2019)，但是细菌的药敏报告通常要到第二天才能拿到，因此，在感染了甲氧西林敏感的葡萄球菌的患者中，有时会出现糖肽化合物代替β-内酰胺类抗生素经验性使用的情况，这导致了治疗中不必要的开支，甚至产生严重的毒性和副作用。大多数耐甲氧西林的葡萄球菌包含外源MecA基因拷贝，MecA基因可以编码对临床上常用的抗生素——β-内酰胺类——具有低亲和力的蛋白PBP2a(Berglund et al.2008；Calazans-Silva et al.2014；Miragaia 2018)。几种基于DNA扩增的实时荧光定量PCR技术已经被用来检测葡萄球菌属的MecA基因(Chung etal.2016；Nijhuis et al.2014；Tang et al.2014)，但这些方法需要复杂的DNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和恒温仪(Chung et al.2016；Nijhuis et al.2014；Tang et al.2014)，这些冗杂的过程甚至伴随着较高的费用无法满足床旁检测和临界值报告的要求，因此，它们的广泛应用受到了限制。相比而言，RNA恒温扩增可以在一个很普通的实验室进行，它没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器(Deng et al.2017；Zhao etal.2015)。由于胶体金免疫层析技术有快速提供结果的潜能，因此将RNA恒温扩增技术即NASBA和胶体金免疫层析法结合起来，建立一个快速可靠的检测葡萄球菌MecA基因的试剂盒有十分地必要和应用价值。