[发明专利]视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

D0：多能干细胞的培养，通过专利CN108085299A公开的方法制备得到多能干细胞，多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的维持培养基为E8或TeSR；培养多能干细胞至70-80%聚合度时，使用TrypLE胰酶或Accutase细胞消化液消化成完全的单细胞，重悬于多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂；Rock抑制剂是Y-27632，浓度为10μM；细胞密度为1-10 x 10⁴/cm²；

D0-D5：多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化：当多能干细胞培养至聚合度70%的时候，将其维持培养基吸除，加入特异性成熟分化培养基，并向特异性成熟分化培养基中加入：BMP抑制剂、Nodal抑制剂、MEK抑制剂、SHH信号通路激活剂、IGF-1 和Wnt抑制剂，BMP抑制剂为Dorsomorphin；Nodal抑制剂为SB431542；MEK抑制剂为PD318088；SHH激活剂为Purmorphamine；Wnt抑制剂为IWR1，每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3 mL/cm²培养皿底面积；

D6-D15：视网膜色素上皮前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化：将上述D5的培养基吸除，加入新鲜的特异性成熟分化培养基，并添加小分子FGFR抑制剂和Nodal信号通路激活剂，FGFR抑制剂为SU5402；Nodal信号通路激活剂为TGFβ-1，每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3 mL/cm²培养皿底面积；

D16- D35-40：未成熟视网膜色素上皮细胞进一步成熟分化：将上述D15的分化培养基吸除，加入特异性成熟分化培养基，每两天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.4 mL/cm²培养皿底面积；视网膜色素上皮细胞的纯化：在第25天左右，将特异性成熟分化培养基吸除，用1x DPBS含Ca²⁺和Mg²⁺洗一遍，加入纯化工作液0.2 mL/cm²培养皿底面积，孵育6-8分钟；待杂细胞全部漂起后，吸除上清，加入1x DPBS含Ca²⁺和Mg²⁺洗3遍，纯化后的视网膜色素上皮细胞继续于特异性成熟分化培养基中培养直至完全成熟；

所述特异性成熟分化培养基的成分为：Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM:F-12)，浓度为100%；谷氨酰胺，浓度为1x；烟酰胺，浓度为0-15 mM；人类转铁蛋白，浓度为1-200μg/ml；胰岛素，浓度为1-10 μg/ml；孕酮，浓度为5-10ng/ml；腐胺，浓度为10-20 μg/ml；亚硒酸盐，浓度为1-10 ng/ml；天冬酰胺，浓度为1-20mM；天冬氨酸，浓度为1-20mM；谷氨酸，浓度为1-20mM；甘氨酸，浓度为1-20mM；脯氨酸，浓度为1-20mM；丝氨酸，浓度为1-20mM；丙酮酸钠，浓度为0.5-2mM；抗坏血酸，浓度为100-500 μM；过氧化氢酶，浓度为0.1-0.2mg/ml；微量谷胱甘肽，0.05-0.15mg/ml；视黄醇乙酯酸，浓度为5-10μg/ml；半乳糖，浓度为0.5-1.0 mg/ml；超氧化物歧化酶，浓度为0.3-0.5KU/ml；3,3’,5-三碘-甲状腺激素，浓度为0.1-1.0 μg/ml；肉碱，浓度为0.1-0.2mg/ml；乙醇胺，浓度为0.05-0.1x；皮质酮，浓度为1.0-2.0 μg/ml；

共轭亚油酸，浓度为50-100μg/ml；亚油酸，浓度为50-100μg/ml；醋酸生育酚，浓度为50-100μg/ml；油酸，浓度为50-100μg/ml；哌可酸，浓度为50-100μg/ml；生物素，浓度为0.1-0.2mg/ml。