[发明专利]视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用。所述视网膜色素上皮细胞，其表达MITF和ZO‑1。所述制备视网膜色素上皮细胞的方法，包括以下步骤：S1：培养人多能干细胞；S2：将S1得到的人多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化；S3：将S2得到的视网膜色素上皮前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化；S4：将S3得到的未成熟视网膜色素上皮细胞分化得到视网膜色素上皮细胞。所述制备方法可快速、高效、简便从多能干细胞分化获得视网膜色素上皮细胞。此外，本发明提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用。

背景技术

眼睛黄斑病变是一种慢性眼病，多发生于45岁以上的老年人，年龄越大，发病率也越高。黄斑病变可分为两类：湿性和干性。湿性黄斑病变，占总发病率的10％，是由于视网膜下有异常的血管生长，新生血管破裂，并引起疤痕组织生长。干性黄斑病变，占总发病率的90％，是由于黄斑随年龄增长而发生的一种老化，表现为色素上皮或神经上皮脱离进入玻璃体，形成玻璃疣。不论是湿性，还是干性黄斑病变，都会引起位于脉络膜与视网膜之间的一类单层细胞——视网膜色素上皮细胞，发生明显的病变和丢失。视网膜色素上皮细胞维持着光感受器的更新和再生，光感受器将光转变成大脑可识别的电信号。因此，视网膜色素上皮细胞功能下降，会导致光感受器退化，从而引发视力退化甚至失明。黄斑病变的治疗，目前现代医学并没有特效的治疗方法，临床也常根据病程的阶段，使用抗血管新生、抗氧化、维生素，以及视神经营养类药物进行治疗，以延缓病情进程，但无法治愈或逆转病情发展。

细胞移植治疗黄斑病变是通过选择适当的细胞群，移植于患者的视网膜内，替代受损的视网膜色素上皮细胞以重建或恢复其功能。多能干细胞包括人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，具有无限增殖的能力，并且在体外可以分化为几乎所有功能细胞，包括视觉细胞。因此，多能干细胞为临床上获得体外来源的视网膜色素上皮细胞进行临床移植提供了可能性。

目前已有多篇研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，大体包括两类：自发连续贴壁培养(Spontaneous continuously adherent culture，SCAC)分化和直接诱导分化。前者SCAC分化方法持续的时间较长(大于90天)，且产率和纯度很低(Klimanskaya,I.,2004；Buchholz,D.E.,2009)。后者直接分化的方法虽然可以缩短诱导分化培养的时间，但最终需手动将视网膜色素上皮细胞从培养皿中挑出以和杂细胞进行分离，使得效率低，且极易造成细胞污染；此外，目前很多直接分化的方法大多是联合使用多种细胞因子进行诱导培养，使得每批次实验数据的稳定性较差，且成本相对较高，最主要的是细胞因子大多来源于动物细胞或细菌，成分复杂，很难应用于临床(Idelson M.,etal.,2009；LeachLL.,et al.,2015)。

简而言之，虽然从人多能干细胞体外分化为视网膜色素上皮细胞的过程在原理层面一经较为明确，但具体到现有的分化方法则或者存在分化时间较长、效果不稳定、效率低的问题，以及大多使用了含有血清的培养体系，因而不适于后续临床级细胞制剂的生产。

发明内容

本发明提供了一种可快速、高效、简便的从多能干细胞分化获得视网膜色素上皮细胞的方法及其应用，解决了现有技术中实验人员制备和培养视网膜色素上皮细胞的方法以及使用的试剂中因为种种局限性造成了获得的视网膜色素上皮细胞的数量和质量无法达到实验要求、浪费了实验室研究人员的时间和研发经费等问题。

本发明具体的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种视网膜色素上皮细胞，其表达MITF(小眼球相关转录因子)和ZO-1(紧密连接蛋白)。