[发明专利]鼠肉与山羊肉、绵羊肉多重PCR检测试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1.一种鼠肉、山羊肉与绵羊肉多重PCR检测试剂盒，其特征是，它包含：

(1)线粒体DNA提取体系

P1溶液30mL，P2溶液30mL，P3溶液10mL,P4溶液30mL，P5溶液30mL，P6溶液50mL；

(2)鼠肉、山羊肉、绵羊肉阳性对照品

紫外灯下切下鼠肉、山羊肉、绵羊肉特异性DNA片段，进行凝胶回收；测定其浓度，转化大肠杆菌后涂板过夜培养；蓝白筛选后转入LB液体培养基于37℃恒温气浴振荡器中培养过夜；质粒小提，测定其DNA浓度。选取浓度超过100ng/μL的样本交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。分析测序结果，并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照品。

(3)多重PCR反应体系

鉴定反应体系(3管)800μL；阳性对照反应体系(3管)，鼠肉(C-鼠阳)、山羊肉(C-山羊阳)、绵羊肉(C-绵羊阳)各1管，各50μL；阴性对照反应体系1管，50μL。

(a)鉴定反应体系：总体系为50μL，其中含有反应缓冲液(10×)5μL，dNTP(2.5mmol·L^-1)2-5μL，MgCl₂(2.5mmol·L^-1)3μL，Taq DNA聚合酶1-5μL，引物1、引物2和引物3(10μmol·L^-1)中的每种0.5-2μL，待检样本DNA 1-3μL，余为双蒸馏水；

(b)阳性对照反应体系：总体系为50μL，其中含有反应缓冲液(10×)5μL，dNTP(2.5mmol·L^-1)2-5μL，MgCl₂(2.5mmol·L^-1)3μL，Taq DNA聚合酶1-5μL，引物1、引物2和引物3(10μmol·L^-1)中的每种0.5-2μL，鼠肉、山羊肉及绵羊肉DNA(1:1:1)混合物1-3μL，余为双蒸馏水；

(c)阴性对照液：貂肉或狐狸肉DNA按1：1混合1-3μL。

2.一种鼠肉、山羊肉与绵羊肉多重PCR鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：

(1)鼠、山羊及绵羊三对线粒体DNA特异寡核苷酸引物

在GenBank中下载种属基因序列，再应用NCBI Primer-BLAST在线引物设计软件设计，具体引物序列如下：

引物1(鼠，扩增长度102bp)

Forward primer：5′TGAGGTGCTACCGTTATT3′

Reverse primer：5′GGTGGCTTTGTCTACTGA3′

引物2(山羊，扩增长度219bp)

Forward primer：5′TACTCGGAGACCCAGACAAC3′

Reverse primer：5′GGCTGATTGGGCGGAATATT3′

引物3(绵羊，扩增长度364bp)

Forward primer：5′TTCACCTACTCTTCCTCCAC3′

Reverse primer：5′ATTATGCTCCGTTGCTTT3′

引物由

(2)多重PCR反应条件

分别将鼠肉、山羊肉及绵羊肉基因组DNA加入PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各50μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行:94℃预变性5min，94℃30s，退火50-55℃30s，72℃45s，30个循环，72℃延伸7min,4℃；

(3)结果判定

反应产物使用1.5％琼脂糖凝胶，在DYY-Ⅲ型水平电泳仪上电泳，85mV电泳1h，分子量100bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。凝胶电泳图谱中，鼠、山羊、绵羊在100-400bp处，在与阳性对照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、绵羊(364bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带，空白对照无条带，判定为含有相应肉类成分。