[发明专利]细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，所述细菌化指在肿瘤细胞表面覆盖一层细菌或细菌抗原成分的过程；制备所述细菌化肿瘤细胞疫苗包括以下步骤：

1)氨基化细菌裂解物：

培养细菌，收集细菌体并经冻溶和超声波裂解，细菌裂解上清即为细菌裂解物；在酸性环境下将过量氨基化合物与细菌裂解物混合，使得氨基化合物中带有正电荷的氨基结合到细菌裂解物的蛋白质上，细菌蛋白上的羧基与氨基形成酰胺键，从而将细菌蛋白的羧基转化成带正电荷的氨基，由此使得细菌裂解物带有正电荷；

2)用氨基化细菌裂解物细菌化肿瘤细胞：

将要制备疫苗的肿瘤细胞与步骤1)得到的氨基化细菌裂解物混合并轻摇，使得带有正电荷的细菌裂解物与表面带有负电荷的肿瘤细胞通过正负电荷机制结合在一起，即得到细菌化肿瘤细胞；

3)灭活步骤2)得到的细菌化肿瘤细胞，即制成安全的细菌化肿瘤细胞疫苗。

2.如权利要求1所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，步骤1)氨基化细菌裂解物包括如下步骤：

11)将过量氨基化合物和细菌裂解物混合；氨基化合物包括但不限于乙二胺、N,N-二甲基乙二胺、聚乙烯亚胺；

12)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，并在低温环境中搅拌；每间隔一定时间加进新的EDC，连续一段时间后即制得氨基化细菌裂解物；

13)在超纯水中透析掉没有和细菌裂解物中的蛋白质结合的氨基化合物和EDC成分，即获得氨基化细菌裂解物溶液；

14)再将透析获得的氨基化细菌裂解物溶液调至PH值为7～9。

3.如权利要求2所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，所述氨基化合物采用乙二胺；具体将乙二胺、超纯水、细菌裂解物进行混合后，加入EDC并在4℃环境中搅拌；过程中不断加进新的EDC，连续48～52小时。

4.如权利要求1所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，步骤1)制备细菌裂解物具体包括如下步骤：

培养细菌，收集对数生长期的细菌菌体；

将收集到的细菌菌体先后置于-160℃液氮中半小时以上和37℃水浴中至全部溶解，反复冻融三次；

然后用超声波对冻溶后的细菌进行破碎，在4℃和10000rpm进行离心10～12分钟，取上清即为细菌裂解物；

此后可将细菌裂解物即刻放入-80℃冷冻后用冻干机将其冻干，即得到细菌裂解物冻干粉。

5.如权利要求4所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，步骤1)制备氨基化细菌裂解物具体包括如下步骤：

用1mL 4℃超纯水溶解细菌裂解物冻干粉10mg，完全溶解后成为溶液一；将纯度≥99.5％的乙二胺10μL加入0.5mL 4℃超纯水中，混匀后将PH值调至8～9，加4℃超纯水至1mL后为溶液二；在4℃超纯水125μL中加入EDC 5mg，溶解后成为溶液三；

将溶液一置于放有磁珠的烧瓶中，开动磁珠较轻缓地搅拌；

缓慢地将溶液二加入溶液一中，等溶液一和溶液二完全混合后再将溶液三缓慢加入，此后在4℃环境中搅拌共48小时；

在此过程期间分别在第16和32小时另外加入溶液三各一次，使得EDC持续发挥作用；

最后将以上反应溶液装进MWCO 14K的透析袋中，并将其放入装有4℃超纯水1L的烧杯中透析48小时，透析期间将烧杯放置于4℃的环境中，每间隔8～12小时换水一次，共4～5次，即获得氨基化细菌裂解物溶液；

用BCA试剂盒测氨基化细菌裂解物溶液的蛋白含量，用PBS调整至蛋白含量0.2mg/100μL。

6.如权利要求1所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，步骤2)制备细菌化肿瘤细胞包括如下步骤：

体外培养疫苗相应的肿瘤细胞，达到需要的细胞数量后收集对数生长期的细胞，计数后用PBS溶液将肿瘤细胞数量调整至1×10⁶个细胞/100μL；

然后按比例将肿瘤细胞50μL和氨基化细菌裂解物溶液50μL混匀，室温下轻摇30钟并用X线灭活后即成为细菌化肿瘤细胞。