[发明专利]细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法

说明书

本发明公布了一种细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法。将对数生长期细菌裂解获得细菌裂解物；将过量的含有氨基的化合物溶液和细菌裂解物溶液混匀，在1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的作用下，细菌蛋白上的羧基与乙二胺的一个氨基形成酰胺键，从而将细菌蛋白的羧基转化成带正电荷的氨基，此过程称为氨基化。将带正电荷的氨基化细菌裂解物与肿瘤细胞混合放置一段时间后，氨基化细菌裂解物中的蛋白质结合到细胞表面，成为细菌化肿瘤细胞，再将细菌化肿瘤细胞灭活后制成细菌化肿瘤细胞疫苗。在小鼠肿瘤模型中证实这种疫苗有很好的治疗肿瘤效果，具有良好的转化应用前景。

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞疫苗及疫苗制备技术，尤其涉及一种利用肿瘤细胞制备具有潜在治疗肿瘤作用的新型疫苗及其制备方法。

背景技术

免疫识别的关键环节是免疫系统要对危险信号进行识别，对于入侵的病原生物，危险信号就是病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，而自身异常的细胞则是损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)。当前应用的有效疫苗几乎都针对细菌、病毒等病原微生物，其中最重要的原因是细菌和病毒能供给免疫系统有效的PAMPs信号。

肿瘤免疫方法多种多样，总体可归纳为被动(passive)和主动(active)免疫两大类，前者包括肿瘤特异抗体、细胞因子和过继免疫活性细胞等；后者包括肿瘤特异或相关抗原的蛋白或多肽疫苗、树突状细胞(DC)疫苗、同种或异种肿瘤全细胞疫苗、Checkpointblocker等。

肿瘤全细胞疫苗是肿瘤免疫技术中的一个重要领域。由于肿瘤细胞是自身细胞，免疫原性较差，免疫系统对自身的肿瘤细胞也处于免疫耐受状态，直接选用经过处理(如辐射)使其不再具备增殖能力的肿瘤细胞作为疫苗效果并不理想。因此，制备肿瘤全细胞疫苗的关键是如何让免疫系统识别自身细胞抗原，进而打破免疫耐受。1993年，英国学者Dranoff等将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)转入黑色素瘤细胞表达并进行辐射处理后用作全细胞疫苗，在小鼠黑色素瘤模型中发现能够诱导树突状细胞(DCs)迁移、分化和成熟，这种DCs能在肿瘤原位处理肿瘤抗原，因而诱导肿瘤特异的免疫反应。此后，采用各种各样的修饰手段便成为肿瘤全细胞疫苗打破免疫耐受的主要技术策略。四川大学学者针对肿瘤组织免疫抑制的微环境，在肿瘤细胞中表达基质纤维母细胞的成纤维细胞激活蛋白，在小鼠肿瘤模型中证明可以有效诱导抗肿瘤免疫反应；美国科学家在肾癌细胞中表达能够让先天免疫系统和DCs相互作用的NY-ESO-1分子，在小鼠模型中发现能促使DCs强有力处理并递呈肿瘤抗原，诱导有效的肿瘤特异免疫反应；爱尔兰研究者采用肿瘤特异光热处理，让肿瘤组织原位释放肿瘤抗原，然后用一种纳米材料加速抗原递呈细胞来处理肿瘤抗原，发现可以有效诱导肿瘤特异的细胞免疫反应；中科院学者利用纳米生物材料将多种(GM-CSF和IL-2)免疫增强成分转入肿瘤细胞，这种肿瘤全细胞疫苗较单成分疫苗具有更好的抗肿瘤效果。目前，尽管有多种肿瘤全细胞疫苗在临床进行试验，但进入III期后都表现不理想，因此，肿瘤全细胞疫苗仍然需要技术改进，才有可能真正转化应用于临床。

发明内容

本发明的目的在于：提供细菌化肿瘤细胞疫苗以及制备方法，该新型疫苗的主要特征为在肿瘤细胞表面覆盖一层细菌抗原成分；本发明将这种在肿瘤细胞表面覆盖细菌抗原成分的过程称为细菌化；将细菌化的肿瘤细胞灭活后制备成为肿瘤特异疫苗。将本发明的细菌化肿瘤细胞作为疫苗接种于肿瘤模型小鼠皮下(也可血管、肌肉或腹腔内注射等)，可以诱导肿瘤细胞产生特异的免疫反应，具有很好的治疗肿瘤作用，展示了良好的转化应用前景。