[发明专利]羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法

权利要求书

1.一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：用羊肺炎支原体BNCC126187株RPS11基因质粒重组纯化抗原为免疫抗原，制备羊支原体肺炎特异性单克隆抗体；经胶体金颗粒单克隆抗体蛋白标记、纯化、质量鉴定及条件优化，建立羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法；将得到的鼠RPS11单克隆抗体与胶体金探针结合在玻璃纤维膜上，与固相NC膜组装得到金标检测试纸条。

2.根据权利要求1所述的羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：所述羊支原体肺炎特异性单克隆抗体制备方法包括如下步骤：

S1，动物免疫：将纯化的pET28a-RPS11重组蛋白作为免疫抗原对雌性小鼠进行皮下多点注射，经3次免疫后小鼠静脉采血，收集血清包被后，用间接ELISA法检测血清抗体效价，并选择性加强免疫；

S2，间接ELISA检测方法的建立与免疫效价检测：用纯化的pET28a-RPS11重组纯化蛋白作为抗原，按常规方法建立间接ELISA；通过方阵滴定，确定抗原包被浓度以及阳性血清的最佳稀释度，对免疫小鼠进行血清效价检测；

S3，细胞融合：摘除眼球处死小鼠，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合，50％PEG1450作用后，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，培养、观察和记录细胞生长情况；

S4，杂交瘤细胞的筛选与克隆：将SP2/0细胞与免疫小鼠脾脏细胞杂交融合并换液，在显微镜下观察，当融合细胞长至培养孔底面积10％时，吸取上清，用间接ELISA酶标板筛选确定出阳性孔后，按有限稀释法连续亚克隆直至阳性率达100％；细胞定株后扩大培养选用胎牛血清培养基，当细胞密度达到设定值时，离心处理、收集沉淀并冻存；

S5，单克隆抗体小鼠腹水的制备：选择小鼠先用液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞经PBS重悬后接种到小鼠腹腔中，待小鼠腹部膨大后采集腹水，收集腹水离心，准备纯化；

S6，单克隆抗体的纯化：用足够的起始缓冲液平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱；取待纯化的样品上柱，洗涤，收集洗脱液；纯化的单克隆抗体用SDS-PAGE鉴定其纯度。

3.根据权利要求1所述的羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：胶体金免疫层析方法的建立包括如下步骤：

S11，胶体金溶液的制备：取HAuCl₄水溶液加热煮沸，加入枸橼酸三钠水溶液煮沸至橙红色，制备成胶体金颗粒溶液；

S12，胶体金标记蛋白的制备：取若干小玻璃试管，分别加入制备好的胶体金溶液，用碳酸钾溶液将胶体金溶液的PH分别调为梯度植，取RPS11标记单抗溶液加入上述胶体金管中，混匀后室温放置，然后每管分别加入NaCl溶液，混匀，室温静置，观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低PH；再将PH调为梯度最低PH±0.1；重复上述试验；记录仍保持红色的最低PH，即为最适PH；

S13，标记抗体最适量的选择：采用蛋白梯度法确定RPS11标记单克隆抗体与胶体金结合的最适浓度；

S14，胶体金探针的制备和纯化：将最适PH胶体金溶液加入RPS11标记单克隆抗体，在室温下电磁搅拌，制得胶体金－抗体结合物溶液，将BSA加入制得的胶体金－抗体结合物溶液中，室温搅拌，离心，吸出上清，将沉淀物溶于BSA的PB液中重悬，滤膜过滤，保存备用；

S15，胶体金－抗体结合物原液工作浓度的确定和金标垫的制备：用工作液将胶体金－抗体结合物原液按不同比例进行稀释，取胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度；

S16，不同型号硝酸纤维素膜的选择：选择几种不同型号的NC膜，通过包括跑板功能测试、胶体金溶液在不同型号NC膜上流动性、滞后度和背景残留的测试和NC膜的重新选择测试在内的试验，确定最适型号的NC膜；

S17，检测线及质控线条件的建立和优化：将NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度，选择显色效果最优的一组作为RPS11单克隆抗体使用浓度T线和羊抗鼠IgG抗体使用浓度C线；

S18，T线及C线的点膜：用PBS将鼠RPS11单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜；喷好的NC膜置烤干干燥。

4.根据权利要求1所述的羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：金标检测试纸条的组装包括如下步骤：将PVC底板切条，在PVC底板中间粘贴抗体固相NC膜，在PVC底板下端粘贴玻璃纤维膜探针条带，并与固相抗体NC膜部分重叠，然后在下端粘贴样本垫与探针条带部分重叠，在PVC底板上端粘贴吸水纸，并与抗体固相NC膜部分重叠，切成试纸条。