[发明专利]羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法

说明书

本发明公开了一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，包括用羊肺炎支原体BNCC126187株RPS11基因质粒重组纯化抗原为免疫抗原，制备羊支原体肺炎特异性单克隆抗体；经胶体金颗粒单克隆抗体蛋白标记、纯化、质量鉴定及条件优化，建立羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法；将得到的鼠RPS11单克隆抗体与胶体金探针结合在玻璃纤维膜上，与固相NC膜组装得到金标检测试纸条。本发明研制的金标诊断检测试纸条对羊支原体肺炎的诊断检测具有快速、灵敏、特异及操作简便的良好特性，为羊支原体肺炎的早期诊断检测及流行病学调查工作开展奠定了良好的技术基础。

技术领域

本发明涉及畜牧兽医技术领域，特别是一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法。

背景技术

羊支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG)是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoides subsp.Capri，Mmc)和山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.Capricolum，Mcc)等支原体引起的在绵羊和山羊中流行普遍的接触性传染病(徐春光等，2014)。夏末和秋季，气温骤变或长途运输应激时较常发生和流行(陈怀涛，2004)。

根据贵州省畜牧兽医研究所对贵州部分地区非免疫羊群的羊支原体肺炎血清学调查实验表明(文正常等，2011)，羊支原体肺炎已成为一种影响贵州肉羊养殖的主要危害传染性疫病。该病为条件性传染性疫病，潜伏期较长，当临床症状明显时往往处于发病晚期，给治疗带来困难，临床发病羊只多为预后不良，加之生产上盲目使用药物导致的药物抑制给病原分离诊断带来困难。

目前，贵州肉羊专业规模化养殖相对滞后，大部分地区仍以农户小规模分散养殖为主，其分布主要在边远山区，无论从养殖设施条件、规范化养殖生产技术应用以及疫病特异性检测诊断技术设备和实验条件手段等，都难以满足现代养羊生产的技术需求。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术缺陷，提供一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，包括用羊肺炎支原体BNCC126187株RPS11基因质粒重组纯化抗原为免疫抗原，制备羊支原体肺炎特异性单克隆抗体；经胶体金颗粒单克隆抗体蛋白标记、纯化、质量鉴定及条件优化，建立羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法；将得到的鼠RPS11单克隆抗体与胶体金探针结合在玻璃纤维膜上，与固相NC膜组装得到金标检测试纸条。

其中，前述的羊支原体肺炎特异性单克隆抗体制备方法包括如下步骤：

S1，动物免疫：将纯化的pET28a-RPS11重组蛋白作为免疫抗原对雌性小鼠进行皮下多点注射，经3次免疫后小鼠静脉采血，收集血清包被后，用间接ELISA法检测血清抗体效价，并选择性加强免疫；

S2，间接ELISA检测方法的建立与免疫效价检测：用纯化的pET28a-RPS11重组纯化蛋白作为抗原，按常规方法建立间接ELISA；通过方阵滴定，确定抗原包被浓度以及阳性血清的最佳稀释度，对免疫小鼠进行血清效价检测；

S3，细胞融合：摘除眼球处死小鼠，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合，50％PEG1450作用后，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，培养、观察和记录细胞生长情况；