[发明专利]一种利用马来酸全细胞催化合成L-天冬氨酸的菌株与方法在审
| 申请号： | 201910328535.4 | 申请日： | 2019-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN110004102A | 公开（公告）日： | 2019-07-12 |
| 发明（设计）人： | 马江锋;储乐乐;方艳;信丰学;董维亮;章文明;陈可泉;姜岷;欧阳平凯 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/60;C12N15/61;C12P13/20;C12R1/19 |
| 代理公司： | 江苏致邦律师事务所 32230 | 代理人： | 徐蓓 |
| 地址： | 211816 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 马来酸 菌株 全细胞催化 编码基因 天冬氨酸 合成 突变 合成酶编码基因 氨基琥珀酸 基因工程菌 酶编码基因 柠檬酸合酶 天冬氨酸酶 保藏 表达质粒 菌株分类 顺反异构 原料催化 重组质粒 出发菌 构建 敲除 酸酶 催化 生产成本 克隆 基因 转化 | ||
1.一株利用马来酸全细胞催化合成L-天冬氨酸的菌株，其分类命名为Escherichiacoli △fumABC△gltA△argG/pMA，其保藏号为CCTCC NO：M 2019171。
2.权利要求1所述菌株的构建方法，其特征在于，敲除保藏号为CCTCC NO：M 2018521的出发菌株富马酸酶编码基因fumABC、柠檬酸合酶编码基因gltA和精氨基琥珀酸合成酶编码基因argG，同时将天冬氨酸酶编码基因aspA-N217K-T233R-V367G和马来酸顺反异构酶编码基因maiA-G8A-G179A克隆到表达质粒上构成重组质粒，并将其转化至敲除了fumABC、gltA和argG基因的大肠杆菌出发菌株，得到所述基因工程菌，所述fumA基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述fumB基因序列如SEQ ID NO:2所示，所述fumC基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述aspA基因突变N217K-T233R-V367G后序列如SEQ ID NO:4所示，所述maiA基因序列来源Variibacter gotjawalensis突变G8A-G179A后如SEQ ID NO:5所示，所述gltA基因序列如SEQ ID NO:6所示，所述argG基因序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列为引物，质粒pTarget F为模板，PCR扩增得到线性片段1；
(2)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为引物，重复步骤(1)得到线性片段2；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列为引物，重复步骤(1)得到线性片段3；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列为引物，重复步骤(1)得到线性片段4；
(3)将线性片段1用SpeI酶切后进行连接，并将连接后产物转化到感受态中，涂布大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
(4)将阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTargetT1-1质粒；
(5)将线性片段2用SpeI酶切后进行连接转化筛选出阳性重组子进行质粒抽提，获得pTarget T1-2质粒；将线性片段3用SpeI酶切后进行连接转化筛选出阳性重组子进行质粒抽提，获得pTarget T1-3质粒；将线性片段4用SpeI酶切后进行连接转化筛选出阳性重组子进行质粒抽提，获得pTarget T1-4质粒；
(6)以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段5；以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段6；
(7)以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列为引物，片段5和片段6的混合物为模板，重叠PCR扩增得到线性片段7；
(8)将pTarget T1-1质粒用EcoRI线性化后去磷酸化作为载体，与片段7进行吉布森一步克隆，用大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
(9)将步骤(8)中的阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTarget T2-1质粒；
(10)以SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列为引物重复步骤(6)至步骤(9)获得pTarget T2-2质粒；以SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列为引物重复步骤(6)至步骤(9)获得pTarget T2-3质粒；以SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列为引物重复步骤(6)至步骤(9)获得pTarget T2-4质粒；
(11)将pCas质粒导入保藏号为CCTCC NO：M 2018521的出发菌株中，用卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
(12)将步骤(11)中的阳性重组子用阿拉伯糖诱导，制备为感受态；
(13)将pTarget T2-1质粒导入步骤(12)的感受态中，用添加大观霉素和卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
(14)将步骤(13)中的阳性重组子用PCR的方法进行鉴定，筛选出目标菌株，并使用IPTG诱导消除pTarget T2-1质粒，获得菌株1；
(15)将步骤(14)中的菌株1用阿拉伯糖诱导，制备为感受态；
(16)将pTarget T2-2质粒导入步骤(15)的感受态中，用添加大观霉素和卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
(17)将步骤(16)中的阳性重组子用PCR的方法进行鉴定，筛选出目标菌株，并使用IPTG诱导消除pTarget T2-2质粒，获得菌株2；
(18)用步骤(15)至步骤(17)的方法分批导入pTarget T2-3质粒、pTarget T2-4质粒进行基因敲除，并使用IPTG诱导消除导入质粒，获得基因敲除菌株Escherichia coli△fumABC△gltA△argG；
(19)以SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列为引物，pGEMT-maiA质粒为模板，PCR扩增得到线性片段8；以SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列为引物，pGEMT-aspA质粒为模板，PCR扩增得到线性片段9；用DpnI消化后转化大肠杆菌，获得pGEMT-maiA-G8A-G179A和pGEMT-aspA-N217K-T233R-V367G；
(20)以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列为引物，pGEMT-maiA-G8A-G179A为模板，PCR扩增得到线性片段10；以SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列为引物，pGEMT-aspA-N217K-T233R-V367G模板，PCR扩增得到线性片段11；
(21)以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列为引物，片段10和片段11的混合物为模板，重叠PCR扩增得到线性片段12；
(22)将pTrc99a质粒用EcoRI和HindIII线性化后去磷酸化作为载体，与片段12进行吉布森一步克隆，用含氨苄抗性的LB平板筛选出阳性重组子；
(23)将步骤(22)中的阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTrc99A-maiAmut-aspAmut质粒；
(24)将步骤(18)中的Escherichia coli△fumABC△gltA△argG制备为感受态；将步骤(23)中的pTrc99A-maiAmut-aspAmut质粒转化至感受态中，用含氨苄抗性的LB平板筛选出阳性重组子，获得目的基因工程菌株。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于南京工业大学，未经南京工业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201910328535.4/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
