[发明专利]一种利用马来酸全细胞催化合成L-天冬氨酸的菌株与方法

说明书

本发明公开了一种利用马来酸全细胞催化合成L‑天冬氨酸的菌株与方法，所述菌株分类命名为Escherichia coliΔfumABCΔgltAΔargG/pMA，其保藏号为CCTCC NO：M 2019171，构建过程包括敲除出发菌中富马酸酶编码基因、柠檬酸合酶编码基因和精氨基琥珀酸合成酶编码基因，同时将天冬氨酸酶编码基因突变N217K‑T233R‑V367G和马来酸顺反异构酶编码基因突变G8A‑G179A，将两者克隆到表达质粒上构成重组质粒，并转化至之前敲除了基因的菌株中，得到目的菌株。利用该基因工程菌全细胞催化合成L‑天冬氨酸的方法，实现了以马来酸为原料催化合成L‑天冬氨酸的路线，降低了生产成本、高效催化，具有经济性。

技术领域

本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株利用马来酸全细胞催化合成L-天冬氨酸的菌株与方法。

背景技术

L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。

目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，以马来酸为原料的研究比较少。而马来酸相对于富马酸，价格更便宜，资源更丰富，也更容易获得。生物酶法具有反应温和、转化率高、三废易处理等优点，是L-天冬氨酸最佳的生产方式。因此，以马来酸为底物生物催化生产L-天冬氨酸具有很大意义。本发明基于此对天冬氨酸酶aspA和马来酸顺反异构酶maiA进行分子水平优化，构建了一株利用马来酸催化合成L-天冬氨酸的基因工程菌，还公布了该基因工程菌全细胞催化合成L-天冬氨酸的方法，实现了以马来酸为原料催化合成L-天冬氨酸的路线，降低了生产成本、高效催化，具有经济性。

发明内容

本发明要求解决的技术问题是，提供一株利用马来酸全细胞催化合成L-天冬氨酸的菌株，其分类命名为Escherichia coli△fumABC△gltA△argG/pMA，其保藏号为CCTCCNO：M 2019171。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法，敲除保藏号为CCTCC NO：M 2018521出发菌株富马酸酶编码基因fumABC、柠檬酸合酶编码基因gltA和精氨基琥珀酸合成酶编码基因argG，同时将来源大肠杆菌的天冬氨酸酶编码基因aspA-N217K-T233R-V367G和来源Variibacter gotjawalensis的马来酸顺反异构酶A编码基因maiA-G8A-G179A克隆到表达质粒上构成重组质粒，并将其转化至敲除了fumABC、gltA和argG基因的大肠杆菌出发菌株，得到所述基因工程菌，所述出发菌株的保藏号为CCTCC NO：M2018521，所述fumA基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述fumB基因序列如SEQ ID NO:2所示，所述fumC基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述aspA基因突变N217K-T233R-V367G后序列如SEQ ID NO:4所示，所述maiA基因序列来源Variibacter gotjawalensis突变G8A-G179A后如SEQ ID NO:5所示，所述gltA基因序列如SEQ ID NO:6所示，所述argG基因序列如SEQ IDNO:7所示，基因的敲除采用通用的CRISPR/Cas9技术。具体构建及选育方法如下：

(1)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列为引物，质粒pTarget F为模板，PCR扩增得到线性片段1；

(2)以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为引物，重复步骤(1)得到线性片段2；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列为引物，重复步骤(1)得到线性片段3；以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列为引物，重复步骤(1)得到线性片段4