[发明专利]一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法

权利要求书

1.一种利用腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸检测样品的方法，其特征在于，所述腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸包括底板(1)，所述底板(1)上从左到右依次固接有加样垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述加样垫(2)靠近所述硝酸纤维素膜(3)的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜(3)一端上，所述吸水垫(4)靠近所述硝酸纤维素膜(3)的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜(3)的另一端上，所述硝酸纤维素膜(3)上从左到右依次设置有检测带(5)和参照带(6)；

所述检测带(5)由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上，干燥后形成，其中大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物浓度为0.4mg/mL，按1μL/cm的量划膜；所述参照带(6)由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上，干燥后形成，其中抗小鼠二抗浓度为0.4mg/mL，按1μL/cm的量划膜；

所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物是将大田软海绵酸与蛋白质偶联后得到的，所述蛋白质为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA；

所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物的制备方法如下：

步骤(1)，将大田软海绵酸溶于N-二甲基甲酰胺中，加入预先配置好的0.1mg/μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液及N，N-二环已基碳二亚胺溶液，加入ddH₂O，旋涡震荡混匀；大田软海绵酸、N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N-二环已基碳二亚胺、ddH₂O的比例为1mg：50μL：1.55μL：2.85μL：45.6μL；

步骤(2)，室温25-28℃震荡孵育2-2.5h；

步骤(3)，将步骤(2)孵育好的混合液逐滴加入到等体积蛋白溶液中，所述蛋白溶液为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA溶于0.1M NaHCO₃溶液中制备得到的；

步骤(4)，室温25-28℃震荡孵育2-2.5h，得到偶联物；

步骤(5)，用30kDa的离心超滤管超滤离心步骤(4)得到的偶联物，收集滤液，得到含有偶联复合物的溶液；将偶联复合物溶液用0.01M pH7.4 PBS溶解，得到OA-蛋白质偶联复合物；采用人免疫球蛋白hIgG制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-hIgG，采用BSA制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-BSA；

或者，将步骤(4)得到的偶联物用截留分子量为10000的透析带在0.01M pH7.4 PBS缓冲液透析24-48h，收集透析袋内透析产物，离心去除不溶性杂质，所得上清液中加入0.01MpH7.4 PBS，得到OA-蛋白质偶联复合物；

其中，OA特异性抗体标记量子点荧光探针制备方法如下：将制备的OA-hIgG作为免疫原，通过常规杂交瘤技术制备，进一步纯化得到OA特异性抗体，然后采用常规EDC二步法将OA特异性抗体与量子点荧光微球结合，得到OA特异性抗体标记量子点荧光探针；

检测样品的方法如下：

C1，准备检测样品：将海产品去壳洗净淋水后剪碎，取1g剪碎的样品加1mL提取液匀浆，称重取五分之一份匀浆后的样品，加200μL提取液混匀，超声浸提并离心后，取上清液用0.01M pH7.4 PB缓冲液4倍稀释，得到检测样品；当海产品带壳时，则将海产品洗净去壳后再剪碎；

C2，上样分析：将C1中检测样品40μL与38μL上样缓冲液和2μL OA特异性抗体标记量子点荧光探针混匀，反应10-15min，将反应液滴加到腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的加样垫2上，层析20-30min后用蓝光检测仪观察分析，根据检测带5和参照带6荧光强度判断检测结果；检测带5为T线，参照带6为C线；

C3，结果判断：当C线、T线均出现两条荧光条带，且条带荧光强度接近，则检测试纸检测的样品毒素含量低于5ng/mL；当C线出现荧光条带，T线没有荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量高于20ng/mL；当C线出现荧光条带，T线出现较弱的荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量在5-20ng/mL之间；当C线不显荧光条带，无论T线是否有条带，其结果均无效。

2.根据权利要求1所述的利用腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸检测样品的方法，其特征在于，干燥温度为10-37℃。