[发明专利]个体化的粒细胞抗癌活性检测

权利要求书

1.个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：包括以下步骤：

1）肿瘤标本的取材；

2）肿瘤单细胞悬液的制备；

3）去除红细胞及杂细胞；

4）纯化肿瘤细胞；

5）单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养；

6）粒细胞制备；

7）粒细胞抗癌活性检测（CKA）。

2.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述肿瘤标本的取材为，新鲜无菌癌组织是手术切除的未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗的；

取新鲜癌组织1cm³，置于DMEM（含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素）中，4℃储存不超过3小时；

置于超净工作台中，用无菌生理盐水将标本组织冲洗3次；用锐利的眼科剪小心剔除可见血管及坏死组织，迅速浸入含有双抗（青霉素200U/ml，链霉素200mg/ml）及二性霉素2mg/ml的D-Hank’s液中。

3.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述肿瘤单细胞悬液的制备，其中，

将癌组织剪碎剪成1mm³的小块，再用Hank’s液洗三次，转移至新的平皿中；

然后用胶原酶IV(100u／mL)，透明质酸酶（2mg／mL）于37℃振荡条件下消化1h，用滴管反复轻柔吹打成单细胞悬液，PBS洗涤细胞2次；

过80目和200目不锈钢筛网，以去除残留的组织块；

取悬液加入到离心管中；

1000rpm/min，离心5分钟，弃上清液。

4.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述去除去除肿瘤单细胞中的红细胞及杂细胞的方法，

加入细胞沉淀体积的1～5倍红细胞裂解液，充分混匀，室温下以离心半径8cm，1500r／min离心6min，弃上清液，若红细胞未裂解充分，可重复红细胞裂解步骤一次，然后按1：1比例将细胞悬液轻轻滴入盛有75%/100%的ficoll分离液的离心管，400×g离心30min，收集上界面层中的细胞，再用PBS洗涤细胞2次，细胞计数并重悬于DMEM培养液（加10%自体血浆）中；

调整细胞密度至2×10⁶个／mL，取5mL细胞悬液接种到含EGF(20ng／mL)、bFGF(20ng／mL)和胰岛素(1mg／mL)的超低吸附培养皿内，置于37℃、CO₂体积分数为5％及饱和湿度培养箱中培养，每隔48h添加上述细胞因子1次。

5.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述纯化肿瘤细胞，其中，

根据软琼脂法；

制备底层琼脂：配制6％低熔点琼脂，高压灭菌，待其温度降至40℃左右后置于40℃水浴锅备用；

取1mL6％低熔点琼脂，冷却至40℃，迅速加入已经配好的9份预温的37℃的新鲜DMEM培养基（含20％FBS）培养液，混合均匀，倒入培养皿中，每皿3ml，室温凝固备用；

制备上层琼脂：将对数生长期的肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整密度为1×10²/ml，37℃预温，细胞悬液9.5ml和40℃、5％琼脂0.5ml混匀，取混合液2ml加入底层琼脂上，使每皿细胞数约200个，制成双琼脂层；

置于室温待其冷却凝固后置于培养箱中培养7～14d左右镜检，观察软琼脂克隆团的形成情况。

6.根据权利要求1所述的个体化的粒细胞抗癌活性检测，其特征在于：所述单细胞软琼脂克隆团的获取和细胞培养方法，

软琼脂克隆形成第14d置于倒置显微镜下观察，标记并挑出较大克隆团后置于细胞培养瓶中培养；

每天观察有无贴壁细胞生长，若有则弃去含有琼脂渣的培养基，加入新鲜培养基培养，每隔2～3d更换细胞培养液，待细胞铺满瓶底90％左右时传代备用。