[发明专利]破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法

权利要求书

1.一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）标准品的酶解：取破伤风类毒素或白喉类毒素标准品溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；

（2）固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；

（3）高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；

（4）计算特征肽段相对响应强度：以峰面积最高的特征肽段的峰面积为分母，以特征肽段的峰面积为分子，得到各特征肽段相对响应强度I%_标；

（5）样品检测：取待检测的破伤风类毒素或白喉类毒素样品溶液，进行步骤（1）、（2）、（3）、（4），得各特征肽段的相对响应强度I%_样n；根据下述方程计算样品中特征肽段n的回收率Rn%：Rn% = I%_样n / I%_标n x 100%；

（6）判断：Rn%大于100%，说明样品中特征肽段n脱毒程度小于标准品中相应特征肽段的脱毒程度；Rn%小于100%，说明样品中特征肽段n脱毒程度大于标准品中相应特征肽段的脱毒程度；

Rn%在80%～120%之间为重复性良好肽段，根据Rn%良好的肽段数目对脱毒效果进行评价：Rn%良好的特征肽段数目占总肽段数目的80%及以上，60%及以上和60%之下分别为良好、合格和有待改进。

2.根据权利要求1所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤（1）对照品的酶解的具体操作如下：

①取破伤风类毒素或白喉类毒素溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；

②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；

③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；

④加入蛋白酶，或加入碳酸氢铵溶液和蛋白酶，25～37℃酶解4～20小时；

⑤加入甲酸、乙酸或三氟乙酸，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。

3.根据权利要求1或2所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGest^TM；

或/和：所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；

或/和：所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10 mmol/L～2 mol/L；

或/和：所述蛋白酶选自胰蛋白酶、糜蛋白酶。

4.根据权利要求1或2所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体操作如下：

①取100 µL破伤风类毒素或白喉类毒素溶液，加入100 µL蛋白变性剂，60℃孵育15分钟；

②加入10 µL二硫键断裂试剂溶液，60℃反应60分钟；

③冷却至室温，加入10 µL的1 mol/L的碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；

④加入765 µL的50 mmol/L的碳酸氢铵溶液，以及5 µL的0.1 mg/mL的胰蛋白酶溶液或糜蛋白酶溶液，37℃或25℃酶解4～20小时；

⑤加入5 µL的甲酸、乙酸或三氟乙酸，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。

5.根据权利要求1所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤（2）中，固相萃取柱的固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离子交换固定相、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合强阴离子交换固定相。