[发明专利]破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法

说明书

本发明公开了一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法：(1)标准品的酶解；(2)固相萃取富集目标肽段；(3)高效液相色谱串联质谱分析；(4)绘制标准特征肽段表，得到标准品种各特征肽段相对响应强度；(5)样品检测，计算得到样品中各特征肽段的相对响应强度、回收率；(6)根据特征肽段回收率良好的肽段数目对脱毒效果进行评价。本发明的监测方法，首次实现了定量监测破伤风类毒素、白喉类毒素工艺稳定性的方法，解决甲醛脱毒蛋白的工艺缺乏监测方法的问题，将为破伤风疫苗、白破二联、百白破三联、五联苗、多糖蛋白结合疫苗的生产优化和新型多糖蛋白结合疫苗的研发提供有效的定量数据，加快疫苗质量提升进程和新产品研发。

技术领域

本发明涉及一种破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或白喉类毒素(即甲醛脱毒的白喉蛋白)的监测方法，属于疫苗质量评价技术领域。

背景技术

化学脱毒是疫苗常见的生产工艺，通过甲醛或戊二醛与蛋白的作用，减少蛋白的毒性而保留其免疫原性。化学脱毒的外毒素蛋白和外膜蛋白可直接作为疫苗的主要成分，如甲醛脱毒的白喉蛋白(白喉类毒素)和甲醛脱毒的破伤风蛋白(破伤风类毒素)。两者与甲醛(戊二醛)脱毒的百日咳鲍特氏菌蛋白按比例配置成为百白破疫苗。甲醛脱毒的蛋白还可作为疫苗生产的原料，如破伤风类毒素或白喉类毒素可作为多糖蛋白疫苗的载体蛋白。多糖蛋白结合疫苗是将多糖通过化学键与蛋白结合后形成的一类疫苗。用于多糖蛋白结合疫苗的蛋白称为蛋白载体。常用蛋白载体有破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM197。常见的多糖蛋白结合疫苗包括四价脑膜炎疫苗(A、C、W、Y)，Hib疫苗和13价肺炎多糖疫苗(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有不同的免疫用途。如23价肺炎疫苗(多糖疫苗)用于2岁以上儿童和成人，对2岁以下儿童免疫效果较差，而13价肺炎疫苗(多糖蛋白结合疫苗)由于有蛋白载体辅助作用，可以很好的激发2岁以下儿童T细胞的免疫反应，从而达到预防多种肺炎病毒入侵的作用。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有制备工艺更复杂，质量控制更困难的问题。多糖蛋白结合疫苗往往需要先生产出质量良好的多糖疫苗和蛋白载体，再通过化学反应生产多糖蛋白结合疫苗。因此多糖质量、蛋白载体质量和多糖蛋白结合率均应作为多糖蛋白结合疫苗的质量控制指标对破伤风类毒素和白喉类毒素为载体蛋白的多糖蛋白结合疫苗，其质量还受载体蛋白脱毒工艺的影响。因此，甲醛脱毒情况影响着疫苗的有效性和安全性(脱毒时甲醛的浓度、脱毒时间和其它因素是怎样影响蛋白(病毒)的，怎样确保不同批次甲醛脱毒后蛋白的结构一致性，从而提高甲醛为载体的多糖蛋白结合疫苗的批次稳定性和重复性，减少多糖蛋白疫苗质量的不确定性)。但目前除测试毒性和免疫原性外，尚无评价或监测甲醛脱毒工艺的方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，可对破伤风类毒素、白喉类毒素进行稳定性监测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，包括以下步骤：

(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素或白喉类毒素标准品溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；

(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；

(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；

(4)绘制标准特征肽段表：以峰面积最高的特征肽段的峰面积(Am)为分母，以特征肽段n的峰面积(An)为分子，再乘以100％得到各特征肽段相对响应强度(I％_标)；表达成方程：I％_标n＝An_标/Am_标x100％；