[发明专利]Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法

说明书

本发明提供一种Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，所述方法包括将来源于同一个待测序列的所述高质量的碱基序列文件通过构建kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，使用kmer值进行所述高质量碱基序列拼接组装。本发明的Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法可以实现全分析流程自动化，只需设置好相关参数，中间无需人工参与，直接输出结果文件。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法。

背景技术

Sanger测序是DNA测序技术的“金标准”，曾在人类基因组计划中发挥了关键推动作用，并且在现在仍被用来获得高度准确且可信赖的测序数据。

在Sanger测序期间，DNA聚合酶通过向生长链(延伸产物)中加入核苷酸来复制单链DNA模板。链延长发生在引物的3′端，通过与模板的碱基对互补来选择加入到扩增产物中的脱氧核苷酸。

Sanger测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

目前，Sanger测序数据的碱基质量需要根据abi文件中每个碱基对应的峰图值进行人工辨别以及手工去除低质量的碱基，具有一定的人为操作误差，同时现有的方法进行此步骤处理时，只能一条序列进行处理，结束以后输出结果再进行下一条序列的操作，严重影响了分析进度。而进行序列之间的拼接时，同样存在上述问题，一次只能进行一个样本的序列拼接，分析结果完成后才能进行下一个样本的分析。而针对一代Sanger测序数据进行SNP检测时，需要根据abi文件中同一位置的多个峰图值进行辨别，只有当次峰值与主峰值达到一定比值范围，才能判定此碱基位置存在SNP变异，由于目前方法中峰值无法进行数字量化，只能人工根据峰图高度进行估算，存在严重的人为操作误差，如果序列较长时，进行人工SNP判别需要花费大量时间，无法提高工作效率。而且基于一代Sanger测序数据的分析方法，无法在已有方法基础上进行改进以实现质控、拼接以及SNP检测的全自动化分析。

发明内容

在一种实施方式中，本发明提供一种Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据每个待测序列的长度，设计N对引物进行PCR扩增，N为不小于2的整数，N对引物能够完全覆盖待测序列；步骤2：对每个待测序列的扩增产物进行Sanger法测序，每个待测序列生成2N个Sanger测序abi文件，每个待测序列的abi文件进行命名，以便于根据该命名来识别来源于同一个待测序列；步骤3：将所述Sanger测序abi文件转化成文本格式文件，并对碱基信号值做归一化处理；步骤4：通过滑窗方法删除低于预设碱基质量值的序列，同步删除低于预设碱基质量值的序列区域所对应的碱基质量值，获得高质量碱基序列及相应的碱基质量值；步骤5：将来源于同一个待测序列的所述高质量的碱基序列文件通过构建kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，使用kmer值进行所述高质量碱基序列拼接组装；和步骤6：基于步骤4得到的高质量碱基序列及相应的碱基质量值，获得每个碱基位点的次最大碱基信号值和最大碱基信号值的比值，当该值大于预设值时，评估每条拼接组装后的序列的多态性位点，然后储存并输出每条待测序列的多态性位点信息。

在一种实施方式中，所述滑窗方法中使用的滑窗范围为5-20bp，优选地为5-10bp。

在一种实施方式中，所述预设碱基质量值为30-60，优选地为质量值范围为50-60。