[发明专利]一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种膜系统表达文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)分离mRNA；

(2)反转录及二链合成；

(3)cDNA连接接头；

(4)连接接头的cDNA进行分级分离；

(5)将步骤(4)获得的cDNA与pDONR222质粒进行BP重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，经培养得到初级文库；

(6)检测所述初级文库；

(7)制备初级文库质粒：培养经步骤(6)检测合格的初级文库，抽提质粒即得到初级文库质粒；

(8)将步骤(7)得到的初级文库质粒与载体pSPR3na进行LR Clonase II重组酶重组，得到最终次级文库，即所述膜系统表达文库；

其中，所述载体pSPR3na的构建步骤为：在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列所生成的质粒；

其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用Oligotex mRNAMidi Kit方法从100-500微克总RNA中分离mRNA；所述步骤(2)中，用于反转录的mRNA的量为1-5微克。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，使用biotin-attB2-Oligo(dT)Primer进行反转录获得cDNA。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述接头为attB1Adapter F和R。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中，步骤(6)检测合格的文库cDNA50-200纳克与pDONR222质粒150-600纳克，加入BPII enzyme mix 20-100U进行重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，加入SOC培养基1-4毫升培养0.5-3小时后，得到初级文库。

6.如权利要求1～5之任一项所述的构建方法所制备的膜系统表达文库。

7.一种载体pSPR3na，其特征在于，所述载体是在pPR3-N载体的多克隆位点插入包含attr重组序列和ccDB致死基因序列在内的序列所生成的质粒；其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。

8.一种载体pSPR3na的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的一段序列所生成的质粒；其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。

9.一种如权利要求1～5之任一项所述的构建方法、或如权利要求6所述的膜系统表达文库、或如权利要求7所述的载体pSPR3na进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究，用于表达文库的筛选，用于两个已知蛋白间互作关系的研究中的应用。