[发明专利]一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用，所述构建方法通过增加用于反转录的起始总RNA量，无需使用PCR扩增步骤，从而可以减少冗余序列的产生；使用新的终载体质粒pSPR3na，后续可一步生成次级文库并可以多次生成；本发明所述构建方法可以实现降低酵母文库序列冗余度并可以反复生成次级文库的目的。本发明还公开了所述膜系统表达文库在进行膜蛋白‑膜蛋白、膜蛋白‑可溶性蛋白间的互作研究，用于表达文库的筛选，用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的研究中的应用。本发明还公开了一种新的酵母文库终载体质粒。

关于优先权

本申请要求2018年04月24日提交的、申请人为“上海欧易生物医学科技有限公司”、申请号为201810375630.5、发明创造名称为：“降低冗余及文库假阴性率的膜系统建库方案”的中国发明专利申请的优先权。

技术领域

本发明涉及表达文库制备领域，具体涉及一种膜系统表达文库及其构建方法和应用。

背景技术

酵母双杂交(Yeast two hybrid)技术是目前用于分析蛋白相互作用的一种重要技术，被广泛应用在蛋白质组学功能基因组学及细胞信号转导等领域。人们不仅用该方法检测已知蛋白之间的相互作用，更重要的是可以用这种方法发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

通过研究人们发现，酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular)，由两个或两个以上结构上可以分开的，功能上互相独立的结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation doman，DNA-AD)。这两个结构域在分开时仍然分别具有各自的功能，但是由于空间上的距离，导致不能激活转录，只有当两个结构域通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与编码诱饵蛋白(Bait protein)的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein；将编码DNA-AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上，同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS和ADE等氨基酸，因此当将这种酵母培养在缺乏上述四种氨基酸的培养基时酵母无法生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析，以便确定诱饵蛋白和靶蛋白是否存在相互作用。

最初该系统主要用于研究核蛋白的功能，后来经过改造，引入了分裂泛素技术，该技术是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。然而已有的泛素分裂建库技术由于需要的RNA起始量较低，因此建库过程依赖于PCR扩增，从而导致某些高表达的基因丰度增加，而一些低表达基因有可能会丢失。对于丰度高的基因常常需要采用均一化酶的处理，但是这一过程需要对每一个样本进行实验条件摸索，费时费力。同时，PCR容易造成一定程度的污染，使得其对于建库环境，试剂以及操作人员的要求较高。因此，降低膜系统表达文库序列冗余度并易于获得次级文库是建库中亟待解决的问题。

发明内容