[发明专利]人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：

(1)将pB19-4244d载体用Sal I酶切去除B19基因后再连接，得到Z-4244d载体；

(2)将含Sal I和Xho I粘性末端、序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段1与Sal I单酶切的Z-4244d载体片段进行连接，得到Z-4244d2载体；

(3)用Sal I和Hind III酶切序列SEQ ID NO.2所示的DNA片段2和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-2载体；用Sal I、Bcl I双酶切序列SEQ ID NO.3所示的DNA片段3，连接到经Sal I、Bgl II双酶切的Z-4244d2-2载体上得到Z-4244d2-2-3载体；

(5)用Sal I、Apa I酶切序列SEQ ID NO.4所示的DNA片段4和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-4载体；用Apa I、Xho I酶切序列SEQ ID NO.5所示的DNA片段5和Z-4244d2-4载体，连接，得到Z-4244d2-4-5载体；用Kas I酶切序列SEQ ID NO.6所示的DNA片段6和Z-4244d2-4-5载体，连接，得到Z-4244d2-4-5-6载体；

(6)将Z-4244d2-2-3载体用Sal I、Xho I双酶切，连接到经Sal I单酶切的Z-4244d2-4-5-6载体上，得到Z-4244d2-2-3-4-5-6载体；PCR扩增含HBoV1基因组编码区nt518-4139的片段，将该片段与Z-4244d2-2-3-4-5-6载体用BspE I、Bgl II双酶切后，连接，得到人博卡病毒感染性克隆pIHBoV1。

2.一种人博卡病毒1型感染性克隆，其特征在于：通过权利要求1所述的构建方法得到。

3.权利要求2所述的人博卡病毒1型感染性克隆在制备基因治疗载体中的应用。

4.一种基因治疗载体的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：酶切去除权利要求2所述的人博卡病毒1型感染性克隆的人博卡病毒基因1505nt-4138nt，插入含启动子、外源基因的DNA片段，获得基因治疗载体。

5.根据权利要求4所述的基因治疗载体的构建方法，其特征在于：所述的启动子为肿瘤特异性启动子，所述的外源基因为TNF基因。

6.根据权利要求4所述的基因治疗载体的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：

(1)将人博卡病毒感染性克隆pIHBoV1和序列如SEQ ID NO.7所示的DNA片段7用HindIII和Bgl II进行双酶切，连接，得到重组载体；

(2)PCR扩增或合成两端含酶切位点的外源基因片段，将外源基因片段与步骤(1)得到的重组载体通过酶切、连接，得到基因治疗载体。

7.一种基因治疗载体，其特征在于：通过权利要求4-6任一项所述的构建方法得到。