[发明专利]人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用，属于分子生物学及基因工程领域。将人博卡病毒的ITR区序列分为5个片段，分段连接到去除B19基因、添加多克隆位点的pB19‑4244d载体上，得到人博卡病毒1型感染性克隆。本发明的人博卡病毒1型感染性克隆，可用于制备基因治疗载体。酶切去除人博卡病毒1型感染性克隆的人博卡病毒基因1505nt‑4138nt，插入含启动子、外源基因的DNA片段，获得基因治疗载体。本发明构建的人博卡病毒1型感染性克隆可在细胞上有效复制，构建的人博卡病毒基因治疗载体可表达外源蛋白并对肿瘤细胞有杀伤效应。

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因工程领域，具体涉及人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用。

背景技术

人博卡病毒(Human bocavirus)是目前近年来发现的继细小病毒B19之后，第二种能对人类致病的细小病毒，该病毒通常在患有急性呼吸道感染的儿童患者的鼻咽物中检测到，世界范围内对其有广泛的流行病学报道，检出率一般介于2-19％。人博卡病毒1型(Human bocavirus 1，HBoV1)同多种常见的呼吸道病毒共感染，被认为是两岁以下儿童呼吸道病毒感染疾病中，继呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(adenovirus)和鼻病毒(rhinovirus)之后的第四种重要病毒感染源。急性呼吸道感染在发达国家的医院里是儿童感染的头号威胁。

虽然世界各地有众多关于HBoV1的研究和报道，但是绝大多数研究仅仅局限于流行病学调查，对病毒的感染机制和致病机理鲜有深入研究。究其原因，因为实际样本中病毒粒子滴度太低，很难分离得到足够量的病毒基因组DNA；HBoV1没有有效的易感细胞系，无法通过组织培养的方法扩增病毒。而细小病毒核酸末端又具有较强的二级回文结构，难于直接用PCR扩增获知其准确序列。因此，构建人博卡病毒感染性克隆，为HBoV1的各种研究提供了最重要的工具和最基本的信息，有助于详细研究该病毒感染特点，有助于对HBoV1感染机制和致病机理进行深入和广泛的探讨。

HBoV1被发现可作为靶向呼吸系统疾病的新型基因治疗载体。选用HBoV1作为基因治疗载体转导目的基因在靶细胞中的表达，具有下述优点：首先，HBoV1基因结构简单，存在复制非必须基因，为外源基因的插入提供了位点；其次，HBoV1操作容易，实验流程简单快捷，重组病毒易于构建，容易获得高滴度病毒粒子；三，HBoV1可感染原代细胞，感染效率高、稳定性高；四，HBoV1的感染具有很高的靶细胞/组织特异性；五，人博卡病毒的感染具有较低的免疫原性。

目前，关于HBoV1的致病机理及其与呼吸系统疾病的关系已成为研究热点，以HBoV1为对象，构建基因治疗病毒载体，在呼吸系统疾病的基因治疗方面有潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人博卡病毒1型感染性克隆，本发明的目的还在于提供人博卡病毒1型感染性克隆的应用以及一种基因治疗载体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种人博卡病毒1型感染性克隆，含有左右两端回文序列，可在细胞中进行核酸复制，通过分段连接人博卡病毒基因至载体，具体为通过包括下述步骤的方法构建得到：

(1)将pB19-4244d载体用Sal I酶切去除B19基因后再连接，得到Z-4244d载体。

(2)将含Sal I和Xho I粘性末端、序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段1与Sal I单酶切的Z-4244d载体片段进行连接，得到Z-4244d2载体。

(3)用Sal I和Hind III酶切序列SEQ ID NO.2所示的DNA片段2和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-2载体；用Sal I、Bcl I双酶切序列SEQ ID NO.3所示的DNA片段3，连接到经Sal I、Bgl II双酶切的Z-4244d2-2载体上得到Z-4244d2-2-3载体。