[发明专利]一种融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种融合蛋白及其制备方法与应用，属于新药物技术领域。本发明的融合蛋白包括锚定蛋白和PD‑L1蛋白。本发明的融合蛋白能同时表现出锚定蛋白和PD‑L1的功能，体外、体内动物模型实验证实该融合蛋白map‑PD‑L1能高效结合在细胞膜上(包括脏器组织的内皮细胞膜)，且能在体外抑制T细胞的活化和促进T细胞凋亡，并进一步在体内器官移植模型中实现离体脏器的锚定修饰，可有效改善移植物局部的炎症反应和延长移植物的存活，能应用于临床移植术后排斥反应的防治。

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其制备方法与应用，具体涉及一种锚定融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

移植是治疗终末期疾病患者的首选途径。急性排斥仍是慢性排斥和移植物失功的重要诱因，尽管随着免疫抑制药物的发展，急性排斥得到了一定的控制，但仍有近20％患者术后面临急性排斥的风险。目前，临床上防治急性排斥的发生，主要是依靠术后早期静脉应用大剂量免疫诱导药物，但这种非特异、全身性的诱导方案对患者自身的免疫功能过度抑制，从而增加了患者术后并发严重感染的几率。因此，寻求一种可靶向、特异性作用于移植物的新型免疫诱导方案，将对移植术后急性排斥的防治，改善移植患者的预后具有重大意义。

程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配体PD-L1是一种重要的免疫检查点分子，对免疫作用有负性调节作用，当肿瘤细胞过表达PD-L1时，可诱导PD-1阳性的T细胞失功、耗竭，进而促进肿瘤细胞免疫逃逸的发生。急性排斥的主要效应细胞是T细胞，活化的T细胞可表达PD-1；另外，更多研究发现，除了T细胞外，B细胞、巨噬细胞和NK细胞等均有PD-1的表达。由此，上调供肾局部PD-L1的表达，有可能实现“覆盖式”诱导受者免疫细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞等)失功，进而诱导外周免疫耐受，促进移植肾的成活的作用。

PD-1/PD-L1作为一种重要的免疫检查点，在调控机体免疫平衡方面发挥重要作用，也是影响肿瘤免疫微环境的关键因素。如何清除特异反应性的T细胞，或者抑制受者体内T细胞的活化，将有可能成为抑制移植术后排斥反应的关键切入点。我们的体外研究以及已发表报道证实，PD-L1与其受体PD-1结合后，能有效激活PD-1/PD-L1信号通路，促进T细胞的凋亡和抑制T细胞活化。而在排斥反应发生时活化的T细胞表面可高表达PD-1。由此，我们猜想：增强供肾器官PD-L1的表达，营造供肾局部高水平PD-L1的免疫微环境，有望实现诱导受者排斥反应的主要效应T细胞的失功和凋亡，进而减轻排斥反应损伤程度，诱导外周免疫耐受，促进移植肾的成活。

早期研究，发现通过阻断PD-1/PD-L1途径，可加快心脏移植物的排斥，同时，利用病毒转染技术，使得移植物高表达PD-L1，可延长心脏移植物的存活等一系列现象研究，提示PD-1/PD-L1途径调控在心脏移植耐受中，扮演关键作用。Liu等利用小鼠肝移植模型探讨在无免疫抑制应用前提下，异体肝移植诱导小鼠自发耐受的机制时发现对比脾脏DC细胞，高表达PD-L1分子肝脏DC细胞更容易诱导CD4T细胞向Treg细胞转化，而PD-L1表达缺失的DC细胞不能诱导Treg细胞，进一步在体内肝移植模型中证实高表达PD-L1分子肝脏DC细胞诱导移植物耐受，延长存活的能力更强。同心脏、肝脏等器官移植一样，通过病毒转染DC细胞，使其高表达PD-L1可诱导CD8+T细胞耐受，并可诱导肾移植耐受。综上述，PD-L1/PD-1信号通路在抑制免疫反应，诱导移植免疫耐受方面具有重大意义。