[发明专利]一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 201910333738.2 | 申请日： | 2019-06-06 |
| 公开（公告）号： | CN110066758A | 公开（公告）日： | 2019-07-30 |
| 发明（设计）人： | 陈守文;陈建刚;周梦林;占杨杨;李鑫;杨欢 | 申请（专利权）人： | 武汉骏安生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/75;C12P13/02;C12R1/07 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 430075 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 谷氨酸 芽胞杆菌 启动子 启动子置换 高产 替换 地衣芽胞杆菌 谷氨酸合成酶 构建 合成酶 分子生物学技术 组成型强启动子 生物大分子 诱导启动子 工程菌株 合成基因 野生菌株 操纵子 工程菌 枯草菌 四环素 稳定期 菌株 制备 应用 | ||
1.一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌，其特征在于，它是通过用替换启动子置换地衣芽胞杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶启动子而得到的替换菌。
2.根据权利要求1所述的一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌，其特征在于，所述替换启动子为组成型强启动子P43、稳定期启动子Pylb、四环素诱导启动子Ptet、枯草菌素合成酶簇启动子Psrf中的任一种；所述地衣芽胞杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶启动子为pgsBCAE基因簇启动子。
3.根据权利要求1所述的一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌，其特征在于，所述芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的替换载体；
(2)将聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的替换载体电转至地衣芽胞杆菌WX-02中，获得阳性转化子；
(3)转接培养阳性转化子，得到单交换结合子菌株；
(4)转接培养单交换结合子菌株，并筛选得到双交换菌株，经测序验证后获取替换了聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的地衣芽胞杆菌重组菌株。
5.根据权利要求4所述的一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌的构建方法，其特征在于，所述聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的替换载体的制备方法为：
(1)PCR扩增获取pgsBCAE操纵子启动子区上游同源臂序列A和下游同源臂序列B；
(2)将pgsBCAE操纵子启动子区上游同源臂序列A、替换启动子序列P和pgsBCAE操纵子启动子区下游同源臂序列B连接构成A+P+B融合片段；
(3)酶切A+P+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接；
(4)连接质粒转化大肠杆菌，对阳性转化子验证后获得聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的替换载体。
6.权利要求1-3任一项所述的高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌在产聚-γ-谷氨酸中的应用。
7.一种高效生产聚-γ-谷氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1-3任一项所述的高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌为出发菌株，菌株活化后接入发酵培养基中，摇床通风发酵培养36-48h。
8.根据权利要求7所述的一种高效生产聚-γ-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：甘油或葡萄糖80g/L，柠檬酸钠12g/L，NaNO3 0-15g/L，谷氨酸钠0-60g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铁0.004g/L，硫酸锰0.5g/L。
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