[发明专利]一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种高产聚‑γ‑谷氨酸的芽胞杆菌及构建方法和应用。该芽胞杆菌是通过用替换启动子置换地衣芽胞杆菌的聚‑γ‑谷氨酸合成酶启动子而得到的。具体是分别以组成型强启动子P43、稳定期启动子Pylb、四环素诱导启动子Ptet和枯草菌素合成酶簇启动子Psrf替换地衣芽胞杆菌聚‑γ‑谷氨酸合成基因簇pgsBCAE操纵子的启动子，获得四株pgsBCAE启动子置换菌株。结果表明，四株工程菌的聚‑γ‑谷氨酸产量均显著高于野生菌株。本发明采用分子生物学技术，通过用替换启动子置换芽胞杆菌的聚‑γ‑谷氨酸合成酶启动子制备出能高产聚‑γ‑谷氨酸的工程菌株，为芽胞杆菌高产聚‑γ‑谷氨酸等生物大分子提供一种新策略。

技术领域

本发明涉及生物技术和发酵领域，具体涉及一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆菌胶、多聚-γ-谷氨酸，它是一种通过微生物发酵法制得的生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成，分子量通常为10KD-10000KD。γ-PGA具备良好的水溶性、吸附能力、可被生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在众多领域中具有广泛的应用价值，在医学领域中，可用作药物缓释剂；在污水处理方面，可作为吸附剂和絮凝剂；在农业领域，可作为保水剂，增肥剂，增效剂。由于γ-PGA 具有良好的经济价值和广泛的应用前景，γ-PGA的生产受到愈来愈广泛的重视。

目前对γ-PGA合成的研究主要集中在强化前体物供应、氧的供应、γ-PGA 降解等方面，熊欢等将透明颤菌血红蛋白编码基因(vgb)整合到B.licheniformis WX-02染色体中，工程菌M2能正常表达VHb，菌体摄氧能力增强，生物量比出发菌株提高25.5％，γ-PGA产量提高20％。Jiang等在地衣芽胞杆菌中过表达谷氨酸消旋酶基因glr，增加了γ-PGA中D-谷氨酸的含量，同时提高了γ-PGA 的产量。Tian等在地衣芽胞杆菌WX-02中过表达γ-PGA降解酶基因pgdS，γ-PGA 产量提高了54％，且γ-PGA分子量变小。然而对γ-PGA合成酶的表达对γ-PGA 合成的影响研究报道较少。γ-PGA主要由γ-PGA合成酶将谷氨酸单体聚合而成。γ-PGA合成酶由PgsB，PgsC，PgsA和PgsE四个亚基组成，其中PgsBC具有γ-PGA 聚合酶活性，是γ-PGA合成所必需的，PgsA和PgsE可能在γ-PGA的运输中起重要作用，这四个亚基分别有pgsB、pgsC、pgsA和pgsE四个基因编码，它们组成一个操纵子，由同一个启动子进行转录。该启动子受到复杂的转录调控，受双组分调控因子DegS-DegU，ComP-ComA和转录因子DegQ调控。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用，本发明首次通过用替换启动子置换地衣芽胞杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶启动子，从而显著提高了地衣芽胞杆菌合成聚-γ-谷氨酸的能力。本发明为芽胞杆菌高产聚-γ-谷氨酸等生物大分子提供了一种新策略。

本发明的第一个目的在于提出一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌，它是通过用替换启动子置换地衣芽胞杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶启动子而得到的替换菌。

进一步地，所述替换启动子为组成型强启动子P43、稳定期启动子Pylb、四环素诱导启动子Ptet、枯草菌素合成酶簇启动子Psrf中的任一种；所述地衣芽胞杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶启动子为pgsBCAE基因簇启动子。

进一步地，所述芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02。

本发明的第二个目的在于提出一种如上述任一项所述的高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)获得聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的替换载体；

(2)将聚-γ-谷氨酸合成酶启动子的替换载体电转至地衣芽胞杆菌WX-02 中，获得阳性转化子；