[发明专利]可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用

说明书

本发明提供了一种含有SEQ ID NO.1所示序列或与该基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列的外壳蛋白基因的表达载体，该表达载体转化后得到的转基因微藻，以及含有该转基因微藻的饲料。本发明采用含有本发明外壳蛋白基因的表达载体，通过遗传转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻后，喂食石斑鱼幼鱼，使石斑鱼持续获得抗原的刺激免疫，达到对鱼类病毒性神经坏死病的预防和治疗，能有效防控石斑鱼神经坏死病，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值，例如具体实施方式中将含有本发明外壳蛋白基因表达载体转化衣藻，获得工程藻株，喂养石斑鱼幼鱼，能够有效降低石斑鱼神经坏死病病死率。

技术领域

本发明涉及一种可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)是养殖鱼类常见的疾病之一，主要感染40余种海洋鱼类的幼鱼和稚鱼，给水产苗种养殖企业带来巨大的经济损失(Lin C al.,2007Mu Y al.,2013)，患病鱼临床症状为食欲降低、行为异常、转圈、鱼体发黑、或腹部朝上漂浮于水面，难于下沉，病鱼腹部肿大(Costa JZ al.，2016)，累积死亡率可达到65-100％。珍珠龙胆石斑鱼，是棕点石斑鱼(俗称老虎斑，母本)与鞍带石斑鱼(俗称龙胆斑，父本)杂交培育的新品种，除食用之外，还可以用作观赏鱼养殖，市场前景广阔。由于受神经坏死病毒(nervous necrosis virus，NNV)感染，使珍珠龙胆石斑鱼育苗生产造成极大损失。目前对于此病毒病还没有特效药物。VNN的病原是病毒性神经坏死病毒(nervousnecrosis virus，NNV)，在分类上属于罗达病毒科(Nodaviridae)，野田村病毒属，由2个分子的单股正链RNA1和RNA2组成病毒基因组，分别编码复制酶和外壳蛋白(CP)(Munday B Let al.,2002)。

目前对于此病毒病还没有特效药物，治疗方式有鱼用疫苗或口服免疫等。鱼用疫苗包括传统的灭活疫苗、减毒疫苗、多价疫苗，以及新型疫苗，如合成肽疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗。新型疫苗基本都是通过基因工程的方法将抗原基因转入大肠杆菌，获得抗原蛋白(合成肽疫苗、亚单位疫苗)，或直接将抗原基因转入鱼基因组中(DNA疫苗)，获得持续的保护作用。疫苗接种方法有三种方式：即注射、浸泡、口服。由于幼鱼和稚鱼体质羸弱，发育不全，通过传统的注射鱼身获得免疫的方法将造成鱼苗极大的伤害，从而造成很高的死亡率。口服免疫是近年发展起来的一种新型的接种方式，有关鱼类口服免疫机制，一般认为鱼类口服疫苗在肠道蠕动作用下，小分子抗原可经肠粘膜细胞间隙渗透进入血液；大分子抗原则由肠粘膜附着的巨嗜细胞吞噬后，提呈到达相关的淋巴组织，也可经细胞间转运，运输到循环系统，经血液或淋巴液转运至淋巴结产生免疫反应(Schep et al.,1999)。该机制已在鲤鱼(Cyprinus carpio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、金鱼(Carassius auratus)等多种鱼类中得到证实(Rombout et al.，1985；Ezeasor et al.,1980；Temkin et al.,1986)。罗晓春等(2005)对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)相关免疫组织结构进行了研究，结果表明眼角膜、鳃、前肠及后肠等粘膜组织中存在杯状细胞、淋巴细胞、巨嗜细胞等免疫相关细胞，具有完成免疫应答的细胞基础。口服疫苗的优点是操作方便，对鱼体无损伤；缺点是免疫效果比注射法低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，构建含本发明外壳蛋白基因的表达载体，通过遗传转化微藻，得到的转基因微藻，可用于石斑鱼病毒性神经坏死病的生物防控，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值。

本发明的第一个方面是提供一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的饲料，其含有转基因微藻，所述转基因微藻由含有外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻制成，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：

1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；