[发明专利]一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用

说明书

本发明公开了一种甘露糖醛酸C‑5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用，属于基因工程领域。具体公开了一种来源于门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina的具有将甘露糖醛酸C‑5差向异构和裂解褐藻胶两种功能的酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的酶，能高效的将β‑D‑甘露糖醛酸(M)转化为α‑L‑古罗糖醛酸(G)以及将褐藻胶裂解为低聚糖。本发明提供的双功能酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药等领域。

技术领域

本发明涉及一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用，属于基因工程领域。

背景技术

褐藻是海洋中含量丰富的经济类海藻植物，它含有褐藻胶、褐藻糖胶及海带淀粉等多种多糖。其中褐藻胶含量相对较高，占藻体干重的20％-40％。在藻体中，褐藻胶主要以褐藻酸、碱金属盐类(钠盐、钾盐)和二价盐类(钙盐、镁盐)等形式存在。褐藻胶作为褐藻细胞壁的填充物质，为藻体提供硬度和韧性，该生理特性类似于陆生植物中的纤维素。

褐藻胶具有多糖所共有的特性，如保水性及可变的溶液粘度，但褐藻胶作为一种聚合电解质，比中性多糖更容易受离子强度和PH影响。可溶性、粘性、稳定性、离子结合、凝胶性等都是褐藻胶的重要属性。

褐藻多糖是由β-D-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)和它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(Guluronate,G)两种单体组成的线性聚合物。在褐藻多糖中M与G的存在形式有3种：聚甘露糖醛酸片段(Poly-mannuronate,PM)、聚古罗糖醛酸片段(Poly-guluronate,PG)和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸混合嵌段(MG block)。如下结构式所示：

因为褐藻是大型多细胞真核生物，探索其细胞内生物合成途径相较于原核细胞更为困难一些。目前对于褐藻胶生物合成的认识主要来源于对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的研究。目前铜绿假单胞菌聚合、修饰与运输褐藻胶的模型已经推演出来了，根据模型，褐藻胶聚合酶是由多个亚基蛋白(推测的亚基为Alg8、Alg44、AlgX)组成的一个蛋白质复合物，它定位于细胞质膜上。褐藻胶聚合酶将细胞质中的GDP-甘露糖醛酸聚合成初态褐藻胶链，然后存在于周质的褐藻胶修饰酶对初态褐藻胶链进行加工，如差向异构酶(AlgG)将甘露糖醛酸异构为古罗糖醛酸。在棕色固氮菌中也发现了与上述基因同源或是功能相同的基因序列，比如与铜绿假单胞菌的AlgE相似的基因以及异构酶algE1-algE5。

目前海藻多糖及其低聚糖已经广泛的应用于食品、制药、化工等多个领域，获得低聚糖的方法目前主要有化学法、物理法以及生物酶法，其中化学法反应条件苛刻并且反应时间较长；物理法需要多种仪器以及方法联用，操作繁琐，而且产物很难达到要求；生物酶法较为简单，且酶来自于生物，对自然环境污染较小，具有反应条件温和反应高效等优势，成为目前的研究重点。具有广泛的应用前景褐藻多糖和寡糖分子中的M/G比决定其生物活性，如富含M的褐藻多糖和寡糖具有抗肿瘤、免疫调节等作用，而富含G的褐藻多糖具有抗艾滋病等重要应用价值。对于M/G比例为0.5-0.7的海藻酸盐市场需求量大，但是大多数的藻酸盐M/G比值为1.2-1.6，M/G比值为0.4的藻酸盐仅存在于海带中(Laminaria hyperborea和Lessonia trabeculata)。