[发明专利]一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法

说明书

本发明公开了一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法，属于生物技术领域。本发明依据常见淡水鱼类线粒体12S基因序列设计了16条宏条形码扩增引物，包括6条上游引物和10条下游引物，该引物对对鱼类群落覆盖度广、扩增效率高，引物组合可以扩增出长度为70bp至350bp的产物，兼容不同高通量测序平台，这种多引物组合的方法可以降低非特异性扩增，提高PCR成功率，可广泛用作特征条码序列进行鱼类物种鉴定、鱼类多样性分析等研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法。

背景技术

宏条形码（Metabarcoding）是目前最有力的物种多样性分析技术之一，尤其在濒危、珍稀物种的监测中起着重要的作用。随着高通量测序通量的提高和测序成本的降低，宏条形码技术开始越来越多的应用于环境、生物多样性的调查中。其中，环境源DNA包括水样DNA、沉积物DNA、生物膜DNA；生物源DNA是指有生物组织提取出的DNA，例如皮肤、毛发等。DNA的两条链是反向平行结构，人们通常把DNA的羟基（-0H)末端称为3'端，而磷酸基团的末端称为V端。DNA聚合酶不能够从头合成DNA，只能从3'端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。在PCR反应中，引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。但是，对于不同对象，采用不同的方法，设计引物的思路也不尽相同。

目前用于鉴定动物的DNA条形码主要是线粒体细胞色素氧化酶I（COI）基因片段，经检索，中国专利申请号为201210332088.8，申请公开日为2012年12月19日的专利申请文件公开了一种鸟蛤贝类线粒体COI基因扩增引物。该发明利用通用引物扩增得到的66条鸟蛤科mtCOI序列，通过CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件PrimerPremier 5设计5对引物，用216个鸟蛤科个体在10 μL体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，即为NGF5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3’和NGR5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’，该发明的鸟蛤科贝类线粒体COI引物可有效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段，能够满足鸟蛤遗传多样性研究的需要。

再如，中国专利申请号为201010254709.6，申请公开日为2011年1月12日的专利申请文件公开了一种骨螺科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法。该发明的步骤为：a、用COI通用扩增引物扩增出部分骨螺科物种的COI序列，b、将所述的COI通用扩增引物序列与已获得的部分骨螺科物种的COI序列进行比对，找出骨螺科线粒体COI序列在COI通用扩增引物序列段的所有突变碱基，重新合成不同的骨螺科COI扩增引物，c、从新合成的不同COI扩增引物中筛选出扩增骨螺科物种效果最好的一对引物，采用该发明的骨螺科线粒体COI基因扩增引物，可以有效的扩增出骨螺科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究骨螺科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护骨螺科种质资源具有重要意义。

虽然COI基因能够很好区别不同的动物，但由于环境样品中游离的鱼类DNA含量极低，通用COI引物对于鱼类扩增能力很差，使得难以通过环境DNA准确检测鱼类多样性，尤其是对稀有鱼类，传统COI引物几乎无法成功从环境DNA中有效扩增。

尽管有报道称18S引物能够进行大多数动物的物种多样性分析，但是18S引物的PCR产物长度在500-700 bp，超出了大多数二代测序平台的读长，而难以在高通量测序平台上进行测序，这也限制了其在环境物种多样性分析中的应用。