[发明专利]用于检测对虾杆状病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测对虾杆状病毒的特异性引物对以及所述的引物对配合使用的探针。本发明还公开了一种检测试剂盒。本发明以对虾杆状病毒中某段保守基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了对虾杆状病毒的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。与PCR检测方法相比，本发明的方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于检测对虾杆状病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒。

背景技术

对虾(Penaeus orientalis)作为我国最重要的四大淡水养殖虾类之一，每年都会出现大面积的肝胰腺急性传染病，研究资料表明对虾杆状病毒是对虾肝胰腺急性传染病的主要病原。至今为止，对于此类传染病的预防和治疗仍旧很困难。对虾杆状病毒隶属于杆状病毒科，该病毒最早由CouchJ.A.于1974年在墨西哥湾北部水域桃红对虾的肝胰腺中发现，主要分布在中美洲和南美洲沿太平洋地区的哥斯达黎加，厄瓜多尔，巴拿马，美国的佛罗里达、密西西比、德克萨斯和夏威夷群岛等。该病毒可引起桃红对虾、凡纳滨对虾(P.vannamei)、白对虾(P.setiferus)、南美蓝对虾(P.stylirostis)、褐对虾(P.aztecus)、长毛对虾(P.penicillatus)、许氏对虾(P.schmitti)、缘沟对虾(P.semisulcatus)、加州对虾(P.californiensis)等十几种对虾感染发病，对虾幼体对该病毒最为敏感，死亡率可达100％，随着日龄的增长，对虾死亡率逐渐降低。该病毒主要侵害对虾的肝胰腺腺管细胞以及中肠上皮细胞，且仅在感染细胞的细胞核内复制，产生多个形似金字塔状的核内包涵体，也有少量包涵体在粪便中游离存在。对虾杆状病毒病毒粒子大小为74～270nm，为有囊膜的环状超螺旋双链DNA病毒，目前未见完整对虾杆状病毒基因序列的分析报道。

目前对虾杆状病毒检测及鉴定的方法有很多，过去最常用于检测对虾杆状病毒的方法葡萄球菌蛋白A协同凝集实验(SPACOA)，该方法快速、特性性强、无需复杂及昂贵的设备，但灵敏度不是太高。此后，出现了酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测对虾杆状病毒的技术，ELISA检测结果能够量化，容易判断且耗时短，邵健忠等人建立了Dot-ELISA检测MBV的技术，该技术的灵敏度要高于葡萄球菌蛋白A协同凝集实验(SPACOA)，但该方法对酶活性要求也高，依赖酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性，且针对亚型病毒株存在无法区分的问题。另外，该类方法所需的试剂盒价格较昂贵，不利于大面积推广；随着分子生物技术的发展，出现了灵敏度、准确性及稳定性更高的PCR(PolymeraseChain Reaction)技术。

PCR以4种dNTP为底物，在引物存在的情况下，在DNA模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。取微量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，观察是否有目的片段出现。PCR产物的分析一般采用琼脂糖凝胶电泳分析，初步判断PCR产物片段的大小与预计是否一致，令人头痛的问题是普通PCR扩增检测容易出现气溶胶污染，使检测结果出现假阳性。随着分子生物学的发展，逐渐发展了荧光定量PCR技术进行MBV检测手段。