[发明专利]一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法

权利要求书

1.一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：该工程菌为过表达氮代谢调控蛋白NrgB基因的地衣芽孢杆菌，其中含有负载了如SEQID NO：01所示的氮代谢调控蛋白NrgB基因的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL，该地衣芽孢杆菌已于2009年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)通过如SEQ ID NO：02所示的正向引物和如SEQ ID NO：03所示的反向引物PCR扩增所述氮代谢调控蛋白NrgB基因，将其插入到表达载体PHY300PLK-PamyL-TtamyL的组成型启动子PamyL下游的多克隆位点，获得PHY300-nrgB过表达质粒；

(2)将足够的上述PHY300-nrgB过表达质粒通过电转化导入所述地衣芽孢杆菌中，获得所述工程菌；

(3)将上述工程菌的单菌落接种于液体种子培养基中，35-37℃并200rpm的条件下培养12-16h，获得种子培养液；

(4)将上述种子培养基以3-5％的体积比接种于发酵培养基中，30-40℃并150-300rpm条件下培养50-60h，获得发酵液；

(5)将上述发酵液进行离心，获得上清液；

(6)将上述上清液通过乙醇沉淀后，离心获得沉淀；

(7)将上述沉淀溶解于超纯水中，进行真空冷冻干燥，即得所述生物絮凝剂。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述种子培养基由以下配比的原料组成，单位为g/L：葡萄糖7-12，酵母膏0.3-0.6，尿素0.3-0.6，KH₂PO₄ 0.1-0.3，K₂HPO₄ 0.1-0.3，NaCl 0.1-0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.5，蒸馏水，pH 7.2-8.0。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由以下配比原料组成，单位为g/L：葡萄糖13-16，酵母膏0.5-1，尿素1-3，KH₂PO₄ 4-6，K₂HPO₄ 1-3，NaCl 1-3，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.1，蒸馏水，pH 7.2-8.0。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，乙醇沉淀具体为：在所述上清液中加入3-5倍体积的无水乙醇，于3-5℃静置10-13h。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，离心的速度为5000-7000rpm，离心的时间为12-16min，离心的温度为3-5℃。