[发明专利]一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法

说明书

本发明公开了一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法，本发明将氮代谢调控蛋白NrgB基因(nrgB)克隆构建重组表达载体，通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了工程菌，该工程菌在发酵过程中，絮凝活性提高了98.04％，该工程菌可用于多糖絮凝剂的工业化生产，能够提高絮凝效率并降低成本。

技术领域

本发明属于生物絮凝剂制备技术领域，具体涉及一种利用过表达氮代谢调控蛋白基因的工程菌制备生物絮凝剂的方法。

背景技术

氮代谢调控蛋白NrgB是PII调节蛋白家族的成员之一(Microbiology，2003，149，3289-3297)，转化NH⁴⁺和谷氨酸之间的主要氮代谢通量(Microbial Cell Factories，2017，16(1)：22)，主要起到控制氮代谢流的作用。NrgB是铵盐代谢的正向调控蛋白，最佳氮源谷氨酰胺/谷氨酸不存在时，NrgB感知胞外铵盐的浓度，通过激活谷氨酰胺合成酶(GlnA)调节谷氨酸的合成(Proteomics，2006，6(16)：4565-4585)，将胞内主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐。

NrgB在调节氮通量的同时，能够调节絮凝活性物质γ-PGA的合成。谷氨酸是B.1icheniformis属菌株最佳的生长氮源，葡萄糖的存在会抑制NrgB的表达，导致菌体消耗产生的谷氨酸(Proteomics，2007，7(3)：413-423)，而当没有葡萄糖存在时，NrgB表达正常，它是铵盐代谢的正向调控蛋白，可以激活谷氨酰胺合成酶将主要氮源由直接利用谷氨酸转向同化吸收铵盐，最终促进γ-PGA的合成。

生物絮凝剂是一种新型絮凝剂，由真菌和细菌等微生物产生，与传统絮凝剂相比，易被生物降解，无毒，无二次污染。组成的絮凝物质主要是多糖，多肽，蛋白质，脂类和核酸(Applied Microbiology and Biotechnology，1998，50(6)：682-691)。其中，多糖和多肽(γ-PGA)是目前研究报告中最常见的两种微生物絮凝物质(Carbohydrate Polymers，2011，84(1)：454-458)。γ-PGA作为絮凝活性物质在食品、发酵、水处理、制糖工业和微藻收集等领域具有广阔的应用前景(Molecular Microbiology，2005，57(3)：717-726；Biotechnology Advances，2018，36，1424-1433)。多糖絮凝剂也广泛应用于去除工业废水中的色素、悬浮物和重金属离子(Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺)(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2005，44(4)：179-186.；Bioresource Technology，2007，98(2)：361-367.)以及对高岭土溶液(Biotechnology Letters，1996，18(12)：1459-1464；BioresourceTechnology，2018，255，171-179)和微观小球藻(Science of The Total Environment，2018，634：488-496)的絮凝。然而，低产率，低絮凝活性和高价格等因素限制了生物絮凝剂的规模和产业化，以往，大部分关于生物絮凝剂的报道多指向培养基、生长条件的优化和应用领域(ProcessBiochemistry，2014，49(4：576-582)，关于地衣芽孢杆菌的遗传和代谢途径对絮凝剂合成的调控的报道比较少。对于芽孢杆菌在合成多糖和γ-PGA两种絮凝活性物质的代谢途径的了解不够深入(Biotechnology Advances，2018，36，1424-1433)，不利于对该菌的代谢进行调控，因此，通过基因工程改造得到高产优良菌株提高，进一步提高生物絮凝剂活性，同时为絮凝活性物质成分代谢的研究奠定基础，具有重要的经济价值及社会意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用工程菌制备生物絮凝剂的方法。