[发明专利]一种新的测定核糖体失活蛋白的酶活性的方法

说明书

本发明提供了一种测定核糖体失活蛋白活性的方法，包括如下步骤：(1)取核糖体失活蛋白(RIP)与三磷酸腺苷(ATP)于合适温度和pH下反应；(2)使步骤(1)的产物与偶联酶试剂反应；(3)测定550nm处的光吸收值；所述合适温度为53～62℃；所述合适pH为1～3；所述偶联酶试剂(ECR显色剂)含有催化量的腺苷脱氨酶(ADA)、过氧化物酶(POD)、黄嘌呤氧化酶(XOD)，以及过量的4‑氨基安替比林(4‑AA)和N‑乙基‑N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3‑甲基苯胺钠盐(TOOS)。本发明使用ATP为底物，能使核糖体失活蛋白充分发挥其N‑糖苷酶活性，生成大量游离的腺嘌呤，通过检测腺嘌呤有效实现核糖体失活蛋白，包括I型、II型和III型RIP的酶活测定，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种测定核糖体失活蛋白的酶活性的方法。

背景技术

核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins，RIPs)是广泛存在于高等植物中的一类毒蛋白，其作用位点多为细胞核糖体大亚基RNA。该蛋白通过其N-糖苷酶活性，将核糖体RNA(rRNA)中的一个或多个腺嘌呤残基去除，可导致rRNA断链，进而破坏核糖体结构。有研究表明RIPs对多种病菌、害虫具有广谱抗性，其应用面较广。

RIPs活性的测定，是开发出稳定RIPs的产品所必需的环节。为了开发出简单且可靠的RIP活性测定方法，发明人前期专利(申请号201610451601.3)使用rRNA类似物与RIPs反应，产生游离腺嘌呤，再通过腺苷脱氨酶(ADA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)催化反应得到过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶(POD)的作用下与辅助试剂反应，得到具有特定吸收波长的物质——有色醌亚胺；进而通过检测最终的光吸收值来定量反映RIPs的酶活。

腺嘌呤产生的多少，关系到酶活检测的灵敏度及有效性；腺嘌呤产生得越多越好。前述专利的rRNA类似物主要是AMP、NAD⁺和NADH。在提供的试验例中，RIPs与NAD⁺反应时能释放出最大量的腺嘌呤，NADH次之，AMP最少；而核糖体失活蛋白与ATP(三磷酸腺苷)和NADP⁺反应产物中未检测到腺嘌呤的产生。

发明内容

发明人通过研究，偶然发现ATP并非不能作为RIPs的底物，在有非离子型表面活性剂存在时，它被RIPs催化可产生高于NAD⁺和NADH释放的腺嘌呤量，提示RIPs对ATP更为敏感。本发明的目的在于提供一种新的测定核糖体失活蛋白活性的方法。(具体原理如图1所示)。

本发明的技术方案如下：

一种测定核糖体失活蛋白活性的方法，包括如下步骤：

(1)核糖体失活蛋白与三磷酸腺苷混合，于53～62℃和pH1～3的条件下反应；

(2)步骤(1)的产物与偶联酶试剂混合，发生酶促反应和显色反应，反应温度为35～45℃，反应pH为6.5～7.0；

(3)测定550nm处的光吸收值；

所述偶联酶试剂含有催化量的腺苷脱氨酶、过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶，以及足够量转化步骤(2)中酶促反应产生的所有过氧化氢的4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。

如前述的方法，所述步骤(1)中反应温度为55～58℃。

如前述的方法，所述偶联酶试剂中含有：

40mM的N-乙基N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、5g/L的4-氨基安替比林、9U/mL的过氧化物酶、6U/mL的腺苷脱氨酶、6U/mL的黄嘌呤氧化酶。

如前述的方法，可以使用步骤(3)所测得光吸收值来直接表示核糖体失活蛋白的相对活性大小。