[发明专利]基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法

权利要求书

1.基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计和PCR检测引物

在NCBI数据库上查询斑马鱼adgrf3b基因的基因组DNA序列，在SMART网站上分析功能结构域，在The ZiFiT Targeter网站上设计斑马鱼adgrf3b基因的靶位点，位于基因组的第十号外显子上；

两对特异性靶位点PCR引物如下：

F1(靶位点a正向引物)：

GCGTAATACGACTCACTATAGGAACGTCTCAGAAGAGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

F2(靶位点b正向引物)：

GCGTAATACGACTCACTATAGGGCATGCTTATTGGGTACTGTTTTAGAGCTAGAAATAG

R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT

PCR检测引物

PCR检测引物上下游引物分别位于adgrf3b第十号外显子上：

F(5’-GTATCCAGCACAGTTGAGAAC-3’)

R(5’-GACCAGACCAAGAACTCAATG-3；

通用模板序列为：

TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT

步骤二：PCR产物进行基因特异性gRNA体外合成

2.1)以合成的DNA为模板，通过特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；

正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bp gRNA上游骨架，反向引物R：20bp gRNA下游骨架，

PCR反应体系如下：

震荡均匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；

2.2)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；

2.3)测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，体系如下：

体外转录反应体系：

将反应物全部加入0.2mL EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；

水浴结束后，消化DNA模板，然后电泳；

2.4)特异性gRNA的纯化

用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并用Nano drop测定纯化之后的gRNA浓度；

步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射

在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，

在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 mRNA的终浓度为150ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射约1.0nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28.5℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；

显微注射体系如下：

步骤四：Sanger测序检测靶位点的有效性

对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其adgrf3b基因是否存在突变；

4.1)提取斑马鱼基因组

斑马鱼胚胎受精36小时后(36hpf)，分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mL Ep管中，每管2颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：

向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解过夜；

裂解完成后，放在震荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；

加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；

加入60μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率；

4.2)PCR扩增目的序列

提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用PrimerPremier5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；

PCR反应体系如下：

震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；

4.3)用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，野生型基因组进行PCR扩增会出现320bp的条带，基因敲除后的PCR产物会出现320bp的野生型条带以及186bp的基因敲除条带，在紫外下切186bp的基因敲除下目的条带，进行纯化回收；

4.4)送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；

4.5)注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；

步骤五：目的序列的TA克隆

PCR初步鉴定有大片段缺失目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；

步骤六：质粒的Sanger测序

将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；

步骤七：获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代

通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28.5℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出320bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条186bp左右的小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现186bp的小带；

如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；

步骤八：获得斑马鱼突变体的F2代纯合子

从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28.5℃培养，受精2两天后取部分胚胎进行鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出186bp靶位点附近区域，通过PCR扩增分析并测序，初步检验是否可以得到adgrf3b突变体纯合子；挑选检验结果证明存在纯合子，养大后再单条剪尾鉴定；

步骤九：重复步骤八，可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。