[发明专利]基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法

说明书

本发明提供了基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的adgrf3b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养36小时后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性；本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中敲除特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因；且干扰掉adgrf3b基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示肠道及其上皮细胞形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上肠道相关疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，尤其涉及基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法。

背景技术

adgrf3b基因位于斑马鱼第20号染色体上，包含14个外显子和13个内含子，cDNA全长5421bp，编码1016氨基酸，发现adgrf3b在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别是肠道中强烈表达。

斑马鱼与人类肠道发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且adgrf3b基因进化上较为保守，研究发现adgrf3b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的adgrf3b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度150ng/μL)，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养60h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。

一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，在2013年初提出，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供了基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出adgrf3b基因缺失型斑马鱼。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法，

步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计和PCR检测引物

在NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库上查询斑马鱼adgrf3b基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计adgrf3b基因的靶位点。