[发明专利]一种检测番茄主要病毒的多重PCR引物组及其应用

说明书

本发明公开了一种检测番茄主要病毒的多重RT‑PCR引物组及其应用。所述引物组序列如SEQ ID No.1~No.10所示，可检测出烟草花叶病毒、辣椒脉斑驳病毒、辣椒脉黄化病毒、番茄褪绿病毒和番茄环纹斑点病毒等5种侵染番茄的主要病毒侵染。利用所述引物组对番茄染病组织进行多重RT‑PCR检测，可同时快速检测出多种病原病毒，具有高效、经济和简便的特点。

技术领域

本发明属于生物检测领域，进一步属于植物病毒检测领域，具体涉及一种番茄主要病毒的多重PCR引物组及其应用。

背景技术

番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一，2011年世界番茄栽培面积约 805 万亩，年产量约 3 773万t，我国是世界番茄种植大国之一，2011年面积96667 公顷，产量约 679万 t，随着番茄种植面积不断扩大，番茄病毒病的危害逐年加重。对云南省番茄病毒病进行调查发现，侵染番茄的病毒病原主要有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus TMV) 、辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus, ChiVMV）、辣椒脉黄化病毒（Pepper veinyellows virus, PeVYV）、番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus ,ToCV）、番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus, TZSV），且调查中发现这些病毒常复合侵染，直接影响番茄的产量和质量，造成严重的经济损失。而目前尚缺少针对以上病毒进行多重RT-PCR的检测技术。

目前常见的植物病毒检测方法有电镜法、血清学鉴定和PCR技术等。

电镜技术是一种简便、灵敏的病毒诊断方法。在电镜下，可直观地观察病毒的形态、大小、表面结构等。电镜检测具有直观、快速的优点，但检测精确性不够，只能根据病毒形态辅助判断病毒属，不能精确到种。

血清学鉴定原理是基于抗体与相应抗原的结合反应，又叫免疫反应。大多数植物病毒编码的病毒蛋白具有良好的抗原性。因此只要制备病毒的抗体，便可利用抗原抗体的特异性反应来判断植物的带毒情况。目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附法（ELISA），其中以双抗体夹心法最为经典。双抗体夹心法是在特定的支持载体上加入待检抗原的抗体，然后再加入待检样品，最后加入对应的酶标抗体，使形成抗体-抗原-抗体的夹心复合物。由于最后加入的抗体（二抗）是酶标记的抗体，因此可加入该酶的底物，使产生显色反应，根据显色反应的情况便可判断样品是否含有抗原。血清检测具有操作简单、快速、灵敏性高、特异性强等特点，缺点是抗血清的制备时间较长；受自身抗体、非特异性抗体等干扰，易出现假阳性；检测复合侵染的病毒时，灵敏度下降，鉴定比较有难度。

PCR（Polymerase chain reaction, PCR）即聚合酶链式反应，是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定目的 DNA 序列。随着科学技术的发展，PCR 技术已经广泛的应用于多个领域，该技术具有较强的特异性、较高的敏感性和准确性。对于核酸是 DNA 的病毒，直接用 DNA 做模板进行扩增。而对于核酸是 RNA 的病毒，则需先将 mRNA 反转录成cDNA，再用 cDNA 作为模板，进行 PCR 扩增，该方法称 RT-PCR（Reverse transcription,PCR）。RT-PCR 是检测 RNA 病毒的一种快速、有效的方法，灵敏度和精确度比传统血清学方法高。但是单重的RT-PCR技术单次只能检测一种病毒，当需要对样品进行多种病毒检测时，需要要大量的重复工作，同时又会消耗大量的检测试剂。

多重RT-PCR技术是在单重RT-PCR基础上发展起来的一种检测技术。多重 PCR是在同一反应体系中，利用一对或多对引物同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，比普通单重PCR更为高效、经济和简便。不仅具有单重RT-PCR技术的优点，且多重RT-PCR反应一次能同时快速检测多种病原的优点，能满足生产上同时对多种病原进行检测的要求。

为此，我们研发番茄主要病毒的多重PCR引物组，所述引物组可同时快速地检测出侵染番茄的多种主要病毒。

发明内容