[发明专利]稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系及其构建方法和应用，该细胞系含有TIGAR基因，保藏号为CCTCC NO:C201928。通过先扩增仓鼠TIGAR基因并构建质粒；再将构建的质粒与PAX、PMD2G质粒同时转入293T细胞，形成包装好的慢病毒；将其感染BHK细胞后，进行药物筛选，然后扩大培养，即得所述细胞系。该细胞系可增加细胞抗凋亡能力，从而延长细胞存活时间，提高新城疫在细胞中的病毒滴度；并成功构建筛选适合新城疫病毒繁殖的高产细胞株。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是危害我国养禽业严重疫病之一，每年都要使用大量的疫苗来预防此病。目前在我国用于预防新城疫病毒的疫苗全部为利用鸡胚所生产，巨大鸡胚需求量，造成了疫苗生产企业的成本压力，同时鸡胚使用后做为废弃物处理也给社会造成了巨大的环保压力。新城疫疫苗不能使用细胞培养方式来生产的主要瓶颈是，该病毒在常规的细胞系中繁殖效力不高，产量较低，病毒滴度若要达到目前鸡胚疫苗的效果，则需要大量浓缩，造成细胞培养法生产新城疫疫苗的经济效益不高。因此构建支持新城疫病毒高繁殖力的细胞系，是解决当前新城疫疫苗不能通过细胞生产的关键技术难点。

研究表明新城疫病毒(NDV)可诱导受感染细胞中caspase依赖的内源性和外源性凋亡途径，从而产生病变效应，这也是当前新城疫病毒致病的主要机制。细胞凋亡的特征是细胞形态和生化变化，包括细胞膜泡、caspase活化和DNA断裂等。理论上而言构建耐凋亡的细胞系可以延长新城疫病毒感染后细胞的存活时间，进而提高新城疫病毒的产量。

P53抑癌蛋白在细胞应激反应和抑制恶性发展中起着重要作用，P53抑癌蛋白通过协调 DNA修复、诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老和维持基因组稳定性等多种机制调节肿瘤细胞的增殖和侵袭力，防止肿瘤的形成。

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosisregulator， TIGAR)是p53下游的靶基因，具有调节糖酵解、凋亡和抗氧化作用的蛋白。有研究表明，在TIGAR基因中有10RHG 12(Tigar-DRHG)、193PFK210(Tigar-DPFK)和(H11A、E102A和H198A)三种突变体时，不能抵抗U2OS细胞的凋亡，并且Tigar丧失催化果糖-2，6-二磷酸酶(Fru-2，6-P2)的能力，258-261的区域缺失仍能降解Hela细胞中的Fru-2，6-P2，但不能与己糖激酶(hexokinase，HK)相互作用。

专利文献CN103333916A中公开了一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法及其应用，其采用传统的真核质粒转染然后抗生素筛选的构建细胞系，这种方法构建的细胞系其稳定性与慢病毒包装系统而言相差较为明显。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系及其构建方法和应用。本研究扩增出的TIGAR具有抗凋亡功能，稳定表达TIGAR基因后的细胞再感染病毒可以增加病毒滴度；成功构建筛选适合新城疫病毒繁殖的高产细胞株。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系，其含有TIGAR基因，保藏号为CCTCC NO:C201928。所述稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系于2019年3月13日保藏于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心 ，分类命名为：仓鼠肾细胞BHK-HTIGAR。

优选地，所述仓鼠TIGAR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

第二方面，本发明提供了一种稳定表达仓鼠TIGAR基因的BHK细胞系的构建方法，包括以下步骤：

A、扩增仓鼠TIGAR基因并构建质粒；