[发明专利]一种氯霉素直接竞争化学发光高特异性免疫分析方法

说明书

本发明一种直接竞争化学发光免疫定性定量检测氯霉素的方法。本发明的检测方法包括制备酶标抗氯霉素抗体、直接竞争化学发光免疫检测、建立工作曲线方程和待测样品的氯霉素定量检测。本发明中改良的高碘酸钠法采用饱和NaBH₄甲醇溶液进行还原反应，克服了NaBH₄水溶液极易被氧化、不能长期保存的缺点，从而避免了该溶液现用现配的限制；直接竞争化学发光免疫检测技术提高了检测效率和检测的灵敏度；采用高灵敏的鲁米诺化学发光底物替代传统的TMB底物，极大程度的提高了反应的灵敏度；通过建立工作曲线可以快速、准确的得到氯霉素残留的浓度，降低了检测和计算的复杂程度，适用于广泛的基层检测工作的应用。

技术领域

本发明涉及药物残留检测技术领域，具体涉及一种直接竞争化学发光免疫定性定量检测氯霉素的方法。

背景技术

随着生活水平的日益提高，保健食品越来越受到消费者的追捧，其中抗生素的残留导致的保健食品安全问题已成为全世界关注的焦点。保健食品成分复杂，待测物浓度较低，通常采样量较大，这就对分析方法的灵敏度及快速性提出了更高的要求。直接竞争化学发光酶联免疫免疫分析(Direct chemiluminescent enzyme-linked immunosorbentassay,D-CLIA)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，该方法克服了传统的酶标记技术稳定性以及间接竞争反应操作复杂等缺点，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。

氯霉素(chloroamphenicol)是一种广谱抑菌抗生素，对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用。其抑菌机理为通过可逆地与50S亚基结合,阻断转肽酰酶的作用，干扰带有氨基酸的胺基酰-tRNA终端与50S亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成。但由于氯霉素还可与人体线粒体的70S结合,因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性，严重者能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒细胞性白血病等疾病，因此动物源食品中的氯霉素残留将对人类的健康构成巨大的潜在危害。世界粮农组织和卫生组织对食品中氯霉素的残留量的规定由原来的10μg/kg降为0.1μg/kg。我国农业部于2002年发布的《食品动物禁用兽药及其化合物清单》中亦正式将氯霉素及其盐酯等制剂列为禁用药物，用以保障动物源性食品安全。

目前针对氯霉素的检测主要有仪器分析方法、间接竞争酶联免疫法和酶标抗原直接竞争酶联免疫法。仪器分析技术主要是基于高效液相色谱技术及液相色谱质谱联用技术，该方法灵敏度高，稳定性好。但是仪器分析技术需要复杂且价格昂贵的设备及训练有素的实验人员，该方法需要复杂的前处理技术，因此该方法在现场快速检测技术的应用方面有着很大的局限性。此外仪器分析在前处理过程中及色谱分离过程中需要用到大量的具有挥发性的有毒有害试剂，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿等，容易给实验人员造成危害。

间接竞争酶联免疫法是一种基于抗原抗体特异性结合的免疫技术，相比仪器分析技术，该方法可以用于氯霉素的现场快速检测，但是该方法主要是基于辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗技术进行间接竞争反应，利用标记酶催化四甲基联苯胺(TMB)底物显色对氯霉素进行检测。间接竞争反应相比直接竞争反应多一步酶标二抗的复杂结合过程，反应时间较长，导致检测效率受限；另一方面受底物TMB自身灵敏度的限制，该方法的灵敏度在一定的程度上有很大的局限性。

目前直接竞争酶联免疫技术需要制备特异性酶标抗体，传统的酶标记抗体技术主要采用高碘酸钠法进行制备。首先采用高碘酸钠对辣根过氧化物酶HRP进行活化，活化之后与抗体进行偶联反应，之后采用NaBH₄的水溶液对过量的活化酶进行还原，终止反应，制备辣根过氧化物酶-抗体标记物。高碘酸钠法标记效率高，但是对反应过程中的NaBH₄的储存条件要求较高，目前的方法主要采用水来配置NaBH₄来进行还原反应，而NaBH₄是一种强还原剂，在水中极易氧化，很难保存，因此每次实验都需要重新配置NaBH₄溶液，现场操作复杂，增加成本消耗和人员工作量。