[发明专利]一种牛肉中肌红蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、粗提：取牛肉背最长肌，去除表面筋膜及结缔组织，切碎得到牛肉肉样，向牛肉肉样加入浓度为10mmol/L、pH值为8.0～8.4的Tris-HCl混合缓冲液，然后在转速为10000rpm的条件下匀浆1min后，在温度为4℃的条件下静置提取1h～2h，然后在转速为9600rpm、温度为4℃的条件下离心10min后过滤，得到滤液；所述Tris-HCl混合缓冲液中含有浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液a、1mmol/L的EDTA、0.54mmol/L的甘油和1mmol/L的二硫苏糖醇；

步骤二、盐析：向步骤一中得到的滤液中边搅拌边缓慢均匀加入固体(NH₄)₂SO₄，得到肌红蛋白盐析液，当肌红蛋白盐析液的饱和度为85％～95％时，在温度为4℃的条件下静置30min沉淀蛋白质，然后在转速为10000rpm、温度为4℃的条件下离心30min，得到肌红蛋白沉淀物；

步骤三、透析：向步骤二中得到的肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液b搅拌溶解后，置于截留分子量为8kDa～14kDa的透析袋中，加入浓度为10mmol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液c在温度为0℃～4℃的条件下搅拌并透析24h，透析过程中所述Tris-HCl缓冲液b置换10次，得到高纯度肌红蛋白；

步骤四、凝胶过滤层析：将Sephadex G-75层析柱用浓度为1mmol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液d平衡后，用浓度为0.1mol/L的NaCl混合溶液对步骤三中得到的高纯度肌红蛋白进行线性洗脱，流速为2mL/min，连续收集多管洗脱液至洗脱完毕，每管洗脱液均在波长为280nm的紫外光下进行检测，合并洗脱峰吸收值最大的洗脱液，得到牛肉中肌红蛋白；所述NaCl混合溶液含有浓度为0.1mol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA和10mmol/L的Tris-HCl缓冲液e。

2.根据权利要求1所述的一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，步骤一中所述Tris-HCl混合缓冲液的pH值为8.2，提取时间为1.5h；步骤二中所述肌红蛋白盐析液的饱和度为90％。

3.根据权利要求1所述的一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，步骤一中所述Tris-HCl混合缓冲液的pH值为8.15，提取时间为1.63h；步骤二中所述肌红蛋白盐析液的饱和度为90.93％。

4.根据权利要求1所述的一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤一中所述牛肉肉样与Tris-HCl混合缓冲液的质量和体积比为1g：5mL。

5.根据权利要求1所述的一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，步骤三中所述肌红蛋白沉淀物和Tris-HCl缓冲液b的质量和体积比为1g：2mL。

6.根据权利要求1所述的一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，步骤四中所述NaCl混合溶液的pH值为8.4。