[发明专利]一种牛肉中肌红蛋白的提取方法

说明书

本发明提供了一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，该方法为向牛肉肉样中加入Tris‑HCl混合缓冲液、匀浆、静置、离心，加入(NH₄)₂SO₄静置、离心后，加Tris‑HCl缓冲液b后透析，在层析柱中用NaCl混合溶液洗脱得到牛肉中肌红蛋白。本发明优化Tris‑HCl混合缓冲液pH值、提取时间、肌红蛋白盐析液饱和度提高肌红蛋白的提取量；本发明Tris‑HCl混合缓冲液中含甘油和二硫苏糖醇，甘油维持肌红蛋白结构稳定性，利于快速沉淀析出，二硫苏糖醇保持肌红蛋白的还原性与生物活性，加固体(NH₄)₂SO₄盐析分级沉淀，提高肌红蛋白纯度，4℃进行防止肌红蛋白变性氧化，透析可有效去除残留的盐离子和他小分子蛋白质，提高肌红蛋白的纯度，最后进行凝胶过滤层析分离，不破坏肌红蛋白的结构与功能。

技术领域

本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种牛肉中肌红蛋白的提取方法。

背景技术

在牛肉肌红蛋白提取纯化方法中，Tris-HCl法为常用的肌红蛋白粗提取方法，但现有肌红蛋白提取技术，存在着肌肉组织成分较为复杂，肌红蛋白难以快速稳定地沉淀；且(氧合)肌红蛋白本身易被氧化，不利于纯化后样品的保存应用等问题，需提升肌红蛋白提纯过程中的稳定性，减少肌红蛋白的氧化和变性损耗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，该发明通过优化步骤一中Tris-HCl混合缓冲液的pH值和提取时间、步骤二中肌红蛋白盐析液的饱和度，有效地提高了牛肉中肌红蛋白的提取量；本发明的Tris-HCl混合缓冲液中含有甘油和二硫苏糖醇，甘油在肌肉细胞浆内，形成了类脂膜结构，有效维持了肌红蛋白结构稳定性，更有利于其的快速沉淀析出，二硫苏糖醇避免了肌红蛋白部分敏感位点的氧化，保持了其还原性与生物活性，而后边搅拌边缓慢均匀缓慢均匀加入固体(NH₄)₂SO₄进行盐析，能够实现分级沉淀，使盐析能有效提高肌红蛋白的纯度，4℃条件下沉淀蛋白质，能够防止温度升高导致肌红蛋白变性氧化，盐析后的透析可有效去除残留的(NH₄)₂SO₄盐离子及其他小分子蛋白质，进一步提高肌红蛋白的纯度，最后进行凝胶过滤层析，将肌红蛋白有效的分离出来，而且不会破坏肌红蛋白的结构与功能。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、粗提：取牛肉背最长肌，去除表面筋膜及结缔组织，切碎得到牛肉肉样，向牛肉肉样加入浓度为10mmol/L、pH值为8.0～8.4的Tris-HCl混合缓冲液，然后在转速为10000rpm的条件下匀浆1min后，在温度为4℃的条件下静置提取1h～2h，然后在转速为9600rpm、温度为4℃的条件下离心10min后过滤，得到滤液；所述Tris-HCl混合缓冲液中含有浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液a、1mmol/L的EDTA、0.54mmol/L的甘油和1mmol/L的二硫苏糖醇；

步骤二、盐析：向步骤一中得到的滤液中边搅拌边缓慢均匀加入固体(NH₄)₂SO₄，得到肌红蛋白盐析液，当肌红蛋白盐析液的饱和度为85％～95％时，在温度为4℃的条件下静置30min沉淀蛋白质，然后在转速为10000rpm、温度为4℃的条件下离心30min，得到肌红蛋白沉淀物；

步骤三、透析：向步骤二中得到的肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液b搅拌溶解后，置于截留分子量为8kDa～14kDa的透析袋中，加入浓度为10mmol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液c在温度为0℃～4℃的条件下搅拌并透析24h，透析过程中所述Tris-HCl缓冲液b置换10次，得到高纯度肌红蛋白；