[发明专利]用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体

说明书

本发明公开了用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体，本发明设计出腺苷酸环化酶基因干扰片段，双酶切pUC19‑MtPpdc‑MtTpdc载体和退火后的干扰片段进行连接，获得重组表达载体；将重组表达载体转入嗜热毁丝霉原生质体中，菌株AC1的干扰效果良好。本发明采用siRNA的DNA模板构建嗜热毁丝霉的腺苷酸环化酶干扰表达载体来沉默腺苷酸环化酶，对嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控进行研究，为后续采用基因工程技术提高嗜热真菌纤维素酶产量提供理论基础。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体。

背景技术

随着工业机械化的不断发展以及汽车等耗能设备的大规模使用使得人们对化石等不可再生能源的需求越来越大。但是不可再生能源的数量有限且日渐枯竭，人们将目光转向于自然界中丰富的可再生资源，来缓解目前的能源压力。

木质纤维素是世界上规模最大、分布范围最广、含量最丰富的一类可再生资源，主要以草木、植物落叶、农业废弃物、木材处理废料、食品加工废料、市政废物等形式存在。木质纤维素相对廉价，如果能够对其进行高效利用将其转化为各种为人类所需的能源物质，将有助于缓解目前的能源压力，减少燃烧农作物秸秆所造成的环境污染，起到一定的环境保护作用。

纤维素酶是一类多组分复杂酶系。一般分为3大类，分别是内切葡聚糖酶(EG)，外切葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)。三种酶通过协同作用来降解大分子纤维素产生可利用的单糖从而转化为其他能源物质。EG可以将纤维素非结晶区内部的糖苷键随机水解，产生纤维糊精和低聚糖等物质。CBH能够将纤维素链的还原端或非还原端水解，并释放出纤维二糖。BG将纤维二糖和寡糖水解，并释放可以发酵的葡萄糖。

大自然中，真菌、细菌等微生物都能产生纤维素酶，但是一般应用于工业生产中的多是丝状真菌。经研究发现，与细菌产纤维素酶相比，丝状真菌产酶能力更强，所产的酶系更全、活性更高并且能够分泌到胞外。目前，能够大量分泌纤维素酶的丝状真菌有里氏木霉(Trichoderma reesei)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等，其中里氏木霉被广泛应用于工业化生产。

嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)是一类耐高温的嗜热丝状子囊真菌，其最低生长温度大于等于20℃，最高生长温度可大于等于50℃。它可以产生耐高温的纤维素酶，所产生的大多纤维素酶最适温度在60-80℃之间，所以被称为生产热稳定性纤维素酶的酶工厂，也被称为潜在的高效中高温酶库。

然而，嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控却少有研究，难以采用基因工程技术来提高嗜热真菌纤维素酶产量。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体，本发明采用siRNA的DNA模板构建热毁丝霉的腺苷酸环化酶干扰表达载体来沉默腺苷酸环化酶，对嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控进行研究，为后续采用基因工程技术提高嗜热真菌纤维素酶产量提供理论基础。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示。

另外，本发明还提供实时荧光定量PCR用于检测嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因表达量的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示。

另外，本发明还提供一种用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的试剂盒，其包括用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1～2所示。