[发明专利]磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法

权利要求书

1.一种磷酸化肽段富集的方法，其特征在于，包括蛋白质组样本的裂解、酶解和基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤，其中，所述蛋白质组样本的裂解、酶解后得到的溶液中包含磷酸化肽段和非磷酸化肽段，所述磷酸化肽段和非磷酸化肽段之和为总肽段，在所述基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与总肽段的质量比例为10～100:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与总肽段的比例为20～100:1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质组样本中磷酸化肽段的含量为10微克～1000微克。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤包括：

取二氧化钛，加入富集溶液，涡旋后得到二氧化钛悬浊液；

采用富集溶液将酶解后得到的肽段样品溶解，离心去除沉淀，得到肽段溶液；

将所述二氧化钛悬浊液离心去除液体后加入所述肽段溶液，室温下垂直混匀进行富集，然后离心，上清再次采用二氧化钛进行富集，重复本步骤，得到吸附了磷酸化肽段的二氧化钛；以及

对所述吸附了磷酸化肽段的二氧化钛进行清洗、洗脱、干燥后得到磷酸化肽段；

优选的，所述富集溶液包含体积百分含量为70～80％乙腈，4～6％三氟乙酸，6～10％乳酸以及余量的水；

更优选的，所述富集溶液包含体积百分含量为70％乙腈，5％三氟乙酸，8.3％乳酸以及余量的水；

优选的，用含有60％～80％乙腈和4％～6％三氟乙酸的溶液对所述吸附了磷酸化肽段的二氧化钛进行清洗N次；然后用含有30％～50％乙腈和10％～20％％氨水的溶液洗脱所述吸附了磷酸化肽段的二氧化钛M次，合并洗脱液并真空干燥，即得磷酸化肽段，其中，N和M分别独立的取值自1～4的自然数。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质组样本的裂解采用的裂解液包含摩尔浓度为10mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、摩尔浓度为40mM2,2-二氯乙酰胺、质量体积比0.5％～1.5％的脱氧胆酸钠以及缓冲液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl pH＝8～10；优选的，pH＝8.8；

优选的，所述酶解为采用胰酶进行消化所述蛋白质组样本裂解后得到的全蛋白裂解液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解包括：将所述蛋白质组样本加入所述裂解液后加热变性，然后进行超声裂解，得到裂解液；将所述裂解液离心吸取上清，即得到所述全蛋白裂解液；

优选的，所述加热变性的温度为95℃，时间为5～10min；

优选的，所述超声裂解的时间为3分钟，其中3秒钟超声，3秒钟间歇，振幅25％，超声裂解之后置于冰上静置裂解15分钟；

优选的，所述酶解包括采用胰酶进行消化所述全蛋白裂解液，得到肽段样品。

8.一种磷酸化肽段检测和定量的方法，其特征在于，包括采用如权利要求1至7中任一项所述的磷酸化肽段富集的方法进行磷酸化肽段富集，然后采用液质联用检测系统对所述磷酸化肽段进行单组分深度覆盖检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单组分深度覆盖检测中一级质谱采用高分辨轨道离子阱Orbitrap方式进行检测，二级质谱采用普通离子阱ion trap模式扫描。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液质联用检测系统中采用15～30cm长的分析柱进行肽段分离。