[发明专利]磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法

说明书

本发明公开了一种磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法。其中，磷酸化肽段富集的方法包括蛋白质组样本的裂解、酶解和基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤，其中，蛋白质组样本的裂解、酶解后得到的溶液中包含磷酸化肽段和非磷酸化肽段，磷酸化肽段和非磷酸化肽段之和为总肽段，在基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与总肽段的质量比例为10～100:1。微量样本的应用使得初始肽段需求降至微克级别，扩展了可以检测的样本范围。进一步的，应用脱氧胆酸钠裂解液高效裂解组织或者细胞，结合二氧化钛对磷酸化肽段进行富集，最后应用高效液质联用系统进行单组分检测和定量，可以高效快速的在微量样本中富集和定量磷酸化肽段。

技术领域

本发明涉及分析化学和蛋白质组学领域，具体而言，涉及一种磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法。

背景技术

蛋白翻译后修饰是重要的生命活动调控方式，近年来磷酸化修饰是主要的蛋白修饰研究领域。蛋白磷酸化修饰作用广泛，约有1/3的人体蛋白具有磷酸化修饰。磷酸化修饰也参与人体代谢、发育和应对刺激等生理过程。同时，多种代谢疾病和恶性肿瘤中存在磷酸化修饰的调控异常，因此蛋白磷酸化修饰的研究为这些疾病的诊断和治疗提供帮助。

基于二氧化钛的磷酸化肽段富集技术是磷酸化蛋白质组研究中最常用的技术。其具有操作简便，富集效率高的优势，其磷酸化肽段富集比例可达95％。但该方法也存在一些缺陷，比如初始肽段用量大，重复性差等，这限制了该方法分推广应用。

近年来，质谱技术飞速发展。以赛默飞世尔公司为代表的质谱公司推出了具有超高分辨率的质谱仪，并具有多个检测器。这种质谱仪配合高压液相使用，极大提高了基于质谱的蛋白质组学检测效率，使得大规模临床样本蛋白质组数据集构建成为可能。

因此，目前亟需开发微量磷酸化肽段样品富集和定量磷酸化肽段等方法，从而推动临床疾病分型，分子标志物筛选和疾病治疗靶点的发现。

发明内容

本发明旨在提供一种磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法，以解决现有技术中磷酸化肽段富集初始肽段用量大的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种磷酸化肽段富集的方法。该方法包括蛋白质组样本的裂解、酶解和基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤，其中，蛋白质组样本的裂解、酶解后得到的溶液中包含磷酸化肽段和非磷酸化肽段，磷酸化肽段和非磷酸化肽段之和为总肽段，在基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与总肽段的质量比例为10～100:1。

进一步地，在基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与肽段的比例为20～100:1。

进一步地，蛋白质组样本中磷酸化肽段的含量为10微克～1000微克。

进一步地，基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤包括：取二氧化钛，加入富集溶液，涡旋后得到二氧化钛悬浊液；采用富集溶液将酶解后得到的肽段样品溶解，离心去除沉淀，得到肽段溶液；将二氧化钛悬浊液离心去除液体后加入肽段溶液，室温下垂直混匀进行富集，然后离心，上清再次采用二氧化钛进行富集，重复本步骤，得到吸附了磷酸化肽段的二氧化钛；以及对吸附了磷酸化肽段的二氧化钛进行清洗、洗脱、干燥后得到磷酸化肽段；优选的，富集溶液包含体积百分含量为70～80％乙腈，4～6％三氟乙酸，6～10％乳酸溶液以及余量的水；更优选的，富集溶液包含体积百分含量为70％乙腈，5％三氟乙酸，8.3％乳酸溶液以及余量的水；优选的，用含有60％～80％乙腈和4％～6％三氟乙酸的溶液对吸附了磷酸化肽段的二氧化钛进行清洗N次；然后用含有30％～50％乙腈和10％～20％％氨水的溶液洗脱吸附了磷酸化肽段的二氧化钛M次，合并洗脱液并真空干燥，即得磷酸化肽段，其中，N和M分别独立的取值自1～4的自然数。

进一步地，蛋白质组样本的裂解采用的裂解液包含摩尔浓度为10mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、摩尔浓度为40mM 2,2-二氯乙酰胺、质量体积比0.5％～1.5％的脱氧胆酸钠以及缓冲液。