[发明专利]用于敲除RBP4基因的sgRNA、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种用于敲除RBP4基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列中的至少一条。本发明还提供了一种敲除人肝癌细胞RBP4基因的方法，为利用CRISPR/Cas系统在人肝癌细胞中对RBP4基因进行改造。本发明还提供了一种RBP4基因缺失细胞株，RBP4是一种新型脂肪因子，具有干扰糖脂代谢的功能，还能负性调节胰岛素信号通路进而引起胰岛素抵抗的发生。本发明提供的RBP4基因敲除细胞株为研究RBP4基因提供了有效的平台，有望为糖尿病、代谢综合症、肥胖等疾病的治疗提供新靶点。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用于敲除RBP4基因的sgRNA序列、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入，这类细菌或古细菌基因组的CRISPR序列能表达与入侵者基因组序列相识别的RNA，在CRISPR相关酶(CAS9)的作用下切割外源基因组DNA，达到抵制入侵的目的，经过人为改造后，CRISPR/Cas9系统可以实现在真核细胞中高度灵活且特异的基因组编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新一代基因组编辑技术，目前该技术已被用于构建各类基因敲除细胞系和基因敲除动物模型。

现有实验技术中，与CRISPR/Cas9系统最为相似的是siRNA靶向的基因沉默技术。siRNA是指生物在进化过程中高度保守的双链RNA诱发的基因沉默现象，其影响生物体一系列过程和功能，但在药物等的诱导作用下，被沉默的基因会出现表达回复的现象。与siRNA靶向mRNA抑制基因表达相比，CRISPR/Cas9系统在基因组水平进行基因编辑，可以完全沉默基因的表达，构建真正的基因缺陷型细胞株。

视黄醇结合蛋白4(RBP4)是视黄醇、维生素A等的特异性运载蛋白。RBP4是一种新型脂肪因子，具有干扰糖脂代谢的功能，还能负性调节胰岛素信号通路进而引起胰岛素抵抗的发生。RBP4基因位于染色体10q23～q24区域，该区域的基因大都与2型糖尿病的发生发展有关。研究RBP4基因有望为糖尿病、代谢综合症、肥胖等疾病的治疗提供新靶点。

因此有必要研制一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的RBP4基因缺失细胞株，期望通过研究RBP4基因缺失细胞株为糖尿病、代谢综合症、肥胖等疾病的治疗提供新靶点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于敲除RBP4基因的sgRNA序列、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及其应用。

本发明第一方面提供一种用于敲除RBP4基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列中的至少一条。

本发明第二方面提供一种敲除RBP4基因的方法，为利用CRISPR/Cas系统在人肝癌细胞中对RBP4基因进行改造，具体包括如下步骤：

1)人工合成如本发明第一方面所述靶DNA序列及其互补链；

2)将所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒；其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；

3)将sgRNA重组质粒转染人肝癌细胞，即得敲除RBP4基因的人肝癌细胞。

在本发明一实施例中，所述步骤2)具体包括：将所合成的SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2及SEQ ID NO:3所示序列的核酸对分别插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒；其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；