[发明专利]一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法

说明书

本发明属于细菌发酵、功能菌筛选技术领域，公开了一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法，所述增殖培养基由蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖1.0～5.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、醋酸钠3.0～6.0g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、抗坏血酸0.3～1.0g/L、琼脂0.5～2.0g/L和蒸馏水组成。选择性地添加氯化血红素0.005～0.01g/L等营养物质，帮助某些极端细菌的生长分裂，提高细胞密度，扩大了己酸菌的筛选范围。中途添加乙醇和丁酸钠，促进了己酸合成。发酵容器透明，根据发酵液中产气、产酸的情况来初筛，提高了筛选效率。

技术领域

本发明属于微生物发酵和功能菌筛选、鉴定技术领域，尤其涉及一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：

白酒(baijiu)是中国特有的蒸馏酒。浓香型白酒由于“泥窖固态发酵”的工艺，使之形成了“以己酸乙酯为主，混合少量乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯”的主体香气。己酸作为己酸乙酯的前体物质，主要来自于窖泥中的己酸菌。己酸菌，并没有严格的分类学上的意义，是指一类能产己酸的细菌。许多酒厂之所以能产出高档次的浓香型的原浆酒，大多依赖于使用历史悠久的老窖池。老窖池中的细菌群落中，己酸菌扮演着最重要的角色之一。它们与甲烷菌、硝酸盐还原菌等共生共栖，长期生活在窖泥的深层的微生态环境中，不断地吸收和消耗来自粮食(发生糊化以及糖化)、糟赔、黄水带来的营养物质，并源源不断地产生丁酸、己酸等代谢物。己酸菌的数量，是窖泥质量优劣的重要的衡量指标之一。人们为了“增己降乳”以及“抑制乙酸乙酯的偏高”的目标，对己酸菌的发现、纯培养和开发利用投入了极大的热情。目前已知己酸菌有：克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、粪味梭菌、深红红螺菌、粘液真杆菌和艾氏巨型球菌等。中国工业微生物菌种保存中心(CICC)登记的己酸菌有：ABC-397、CICC8022、CICC8023、CICC8024等。也有人使用C.kluyveri JZZ、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、js-22-03，js-22-07，js-22-12、己酸菌(Clostridiumbutyricum)GK13、DSM555、CICC20860等制备己酸菌液。

己酸菌多为厌氧或兼性厌氧菌，对纯培养的手段有极高的要求。比如，吴衍庸等人采用液态巴氏培养基从泸州老窖窖泥中筛选出泸酒梭菌，产己酸能力为3080mg/L，从五粮液老窖中分离出的己酸菌w-1产己酸能力为10000mg/L。泸州品创科技有限公司使用了梭菌增殖培养基A、乙酸钠培养基B，湖北工业大学陈茂彬等人使用乙醇醋酸钠培养基(EAM)，安徽金种子酒业发明了不加CaCO₃的己酸菌NCEAM培养基，丰谷酒业的杜礼泉等人则在乙酸钠、乙醇、硫酸铵等常用己酸菌培养液组份基础上添加了丢糟浸液、大曲粉、底锅水、黄水等酒厂中的天然物质，加入酒尾、硫酸铵、尿素和黄泥浸提液等物质。

现有技术一为一种不加CaCO₃培养己酸菌的配方，使用了NCEAM培养基，该培养基中不含有葡萄糖、可溶性淀粉，缺少对还原性的L-半胱氨酸盐酸盐，这对于窖泥中很多未知的己酸菌来说有一定的营养缺陷。该培养基使用了2％的乙醇，对于不耐受乙醇的己酸菌，是无法完成发酵试验或者阻碍了某些己酸菌的指数期增殖。仅使用C.kluyveri JZZ作为唯一供试菌，使得该培养基的广泛性受到质疑。检测发酵液中的己酸时，虽然也使用了2-乙基丁酸作为内标物，但是并没有直接将乙醇溶液(含发酵液)进行气相测定，而是增加了一个发酵液、内标液和乙醚充分混合的步骤，最后取上层的乙醚层进行检测。缺陷是：乙醚气体对人体有害，不利于安全操作；发酵液前处理过程不够简便，耗费了人力和试剂；乙醚对己酸的萃取过程会受发酵液中的酸度的影响，而发酵液中没有明显的缓冲试剂，致使不同酸度的发酵液的己酸的萃取得率有差别，定量检测的效果不稳定。